Os autores gostariam de agradecer a Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach pelo seu trabalho inicial no estabelecimento in utero tecnologia eletroporação no laboratório CS. Este trabalho foi financiado por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) conceder (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Equipe Grant (00933-000) para CS e uma crianças de Alberta Hospital Research Foundation Grant para DMK. RD foi apoiado por uma bolsa de estudos Esperança CIHR Canadá, RC é apoiado por um Studentship FFB e LML foi apoiado por uma bolsa de formação CIHR em Genética e Desenvolvimento Infantil.

1. Set-up <ol><li> Set-up área cirúrgica, como mostrado na figura. 1A, A &#39;. Componentes-chave do set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor, Narishige micromanipulador com porta-agulha, steromicroscope Leica, sistema de fibra ótica de iluminação, 830 ECM Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos, almofada de aquecimento e um vaporizador de anestésico isoflurano. </li><li> Limpe todas as ferramentas com um líquido de limpeza ultra-sônica utilizando Bransonic Metriclean2 solução pouca espuma para sonicando instrumentos cirúrgicos. Esterilizar instrumentos em autoclave. Ferramentas esterilizados são então mantidos em Germex. </li><li> Prepare seringas com solução salina estéril morna e estéril solução de Ringer Lactato. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Coloque o animal dentro de um pequeno (12cm x 20cm) anestésico câmara. Usando um vaporizador, entregar 5% anestésico isoflurano e oxigênio em 1l/min (Fig. 1A, A &#39;). Notadamente, é importante recolher escape isoflurano usando um sistema de limpeza. </li><li> Remover animais da câmara quando a respiração torna-se profunda e regular. Beliscar dedo do pé e os exames oftalmológicos blink reflex são usados ​​para garantir a anestesia total. </li><li> Lugar do mouse grávidas em suas costas em cima de uma almofada de aquecimento (37 ° C). A almofada de aquecimento é a primeira esterilizadas, limpando com álcool a 70%, e é então coberto com uma gaze esterilizada, sem fiapos. Use um tubo respirador e aparelho de máscara para entregar isoflurano (2,25%) durante a cirurgia. </li><li> Injetar buprenorfina (0.1mg/Kg peso corporal) por via subcutânea sob a pele na nuca do pescoço. </li><li> Monitor de animal ao longo da cirurgia para a respiração profunda e regular. O animal não deve gasp, respire superficialmente ou rapidamente. Respiração superficial e rápida pode ser um sinal de luz anestesia, eo fluxo de isoflurano deve ser aumentada. Se o animal começa a ofegar, reduzir o fluxo de isoflurano. No caso de uma parada respiratória, desligue o isoflurano, e aumentar o fluxo de oxigênio até que animal se recuperar. Reinicie o isoflurano em menor concentração. </li></ol> 3. Preparação de animais para a cirurgia <ol><li> Tape forelimbs de animal para a almofada de aquecimento e verifique novamente para uma resposta retração apertando o pé hind com uma pinça sem corte. </li><li> Usando um cotonete estéril, espalhe uma camada grossa de creme depilatório (ie, Nair) sobre o abdômen. Em traços firmes, garantir a underfur é completamente revestido. Deixe por uma média de três minutos, verificando de forma intermitente, com uma zaragatoa limpa para remoção de pêlos. Umedeça um chumaço de gaze estéril com água estéril e limpe o abdômen até que todos os vestígios desapareceram. Repita com clorexidina na pele (ou seja, Stanhexidine) mais limpo e mais água. Seque o abdômen com uma gaze limpa e esterilizada. </li><li> Esterilizar local da incisão com clorexidina (ie, Stanhexidine), seguido de mais água estéril. Seque o abdômen com uma gaze limpa e esterilizada. Repita este passo com etanol 70% e um fresco, cotonete esterilizado. </li><li> Coloque uma gaze esterilizada sobre o abdômen com uma fenda no meio através do qual o cornos uterinos será puxado durante a cirurgia. </li></ol> 4. Incisão e exposição dos cornos uterinos <ol><li> Para expor os cornos uterinos, primeiro localize a linha alba como a linha tênue sob a pele na linha média. Utilizando uma pinça, puxar a pele para longe da parede abdominal e cortar uma incisão pequena, em linha reta do baixo abdômen mid-pele com uma tesoura (aproximadamente 1 cm de comprimento). </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras curvas, repita o processo com o peritônio. </li><li> Coloque uma gaze estéril com uma pequena fenda vertical sobre incisão e umedecer com solução salina estéril aquecida. </li><li> Deslize pinça na incisão e localize o útero. Segure incisão aberta com uma pinça, removendo os cornos uterinos. </li><li> Cuidadosamente compreender o útero entre os embriões primeiro e segundo visível e puxar os embriões para a gaze. Remova ambos os lados dos cornos uterinos, colocando sobre a gaze estéril e contar o número de embriões, anotando todas as reabsorções ou &quot;não saudáveis&quot; (por exemplo, menor tamanho do corpo) embriões. Molhe a cornos uterinos com solução salina e cuidadosamente retorno metade do útero no abdômen. </li></ol> 5. Injeção de DNA em Ventrículos <ol><li> Agulhas cirúrgicas são preparados com uma Puller Micropipeta Sutter Flaming usando micropipetas borosilicato com capilares (Programa: calor = 750, Pull = 30, Vel = 90 tempo, = 150). Usando uma lâmina de bisturi estéril, a ponta da agulha é levemente raspado em um ângulo de 45 graus. </li><li> Para carregar a agulha, pipetas Pasteur são puxados para um diâmetro estreita sob uma chama. Um pedaço da boca está ligado à pipeta de carregamento para elaborar ~ mL 10 de DNA endotoxina livre de 3mg/ml misturado com 0,01% verde de metila (nota: corante verde de metila permite injeções de DNA a ser visualizada). A agulha é então enchido montado em um suporte micromanipulador e anexado ao injector FemtoJet. </li><li> Começando com o embrião mais próxima do ovário, circular forcepssão usadas para girar delicadamente o embrião dentro do decidua para que ele seja posicionado &quot;face-forward&quot;, permitindo que as injeções de ocorrer em um rostral à direção caudal. Uma fonte de luz de fibra óptica para a iluminação é usada para ajudar a visualizar a linha média do cérebro embrionário, que é ladeado pelos ventrículos laterais grandes em regiões rostral (Fig. 1B, B &#39;). </li><li> O embrião é mantido em posição com a pinça circular. A agulha é posicionada acima do útero de modo que o ângulo de entrada no cérebro é de aproximadamente 45 graus. Usando o micromanipulador, e um movimento rápido e constante, a ponta da agulha é inserido através da parede uterina e no ventrículo lateral do embrião. Injeções são direcionados para os ventrículos laterais, terceiro ventrículo ou espaço sub-retiniano para atingir o telencéfalo diencéfalo e retina, respectivamente. Note-se que as vesículas cerebrais embrionárias são abertas ao início estágios embrionários de tal forma que o DNA injetado na ventrículos laterais fluirá para o ventrículo 3 º. </li><li> Pressione o pedal para injetar endotoxina livre de DNA (1-3 mL) usando um Eppendorf FemtoJet microinjetor. A injeção de sucesso é facilmente visualizado por difusão do corante verde de metila ao longo dos ventrículos do cérebro embrionário. A agulha é então lentamente removidas por desenho back up para evitar a ruptura. </li></ol> 6. Eletroporação <ol><li> O embrião injetado (ainda dentro do útero) é colocada sobre a gaze esterilizada recobre o abdômen da mãe e molhado abundantemente com soro fisiológico aquecido. Por favor, note ** A adição de solução salina na superfície da membrana é essencial para permitir a passagem eficiente de uma corrente elétrica. </li><li> GenePaddle eletrodos são usados ​​para segurar o útero após a injeção de DNA. Cinco quadrados pulsos elétricos de 40-50V e 50 ms são entregues a uma taxa de um pulso por segundo usando um sistema de eletroporação ECM8300 BTX (Fig. 1C, C &#39;). </li><li> Cobrir o embrião injetado / electroporated com gaze molhada de proteção e continuar para o embrião seguinte. </li><li> Após a conclusão da injeção / eletroporação de todos os embriões desejada, empurre cuidadosamente a cornos uterinos de volta para o abdome (Fig. 1D). </li><li> Remova cuidadosamente o outro chifre uterine e começar de novo com o embrião mais próximo do ovário. </li></ol> 7. Sutura e grampeamento <ol><li> Uma vez que todos os embriões estão de volta dentro do útero, adicione à cavidade abdominal ~ 2-3 ml de soro quente. </li><li> Para fechar a ferida, comece removendo a gaze no abdome e identificar os lados do peritônio. Começar a sutura do peritônio usando a linha de seda preta trançada. Não é recomendado o uso de sutura absorvível para este procedimento, uma vez que é tipicamente mais fraco e pode levar a hemorragia pós-cirúrgica e infecção. Ancorar a linha no peritônio próximo ao esterno e vá para longe do ponto de âncora. Certifique-se todas as suturas são apertadas, e que nenhum órgão de base ou de pele tem sido, inadvertidamente, costurada na peritônio. Clipe da linha de sutura remanescentes e descarte. </li><li> Puxe a pele fechada sobre a linha de sutura com uma pinça. Usando 9 milímetros Reflex ™ pele fechamento grampos, clip da pele sobre a ferida, tomando cuidado para não grampear o debaixo da linha de sutura, ou para puxar a pele com muita força. O método preferido é manter a pele para cima e longe do corpo com uma pinça, e vêm em um ângulo de 90 graus com a ferramenta do grampo. Continue até ferida é fechada (cerca de três grampos). Uma vez terminado, certifique-se grampos estão bem apertados pressionando suavemente junto com a ferramenta de sutura (Figura 1D). </li></ol> 8. Cuidados pós-cirúrgicos <ol><li> Para monitorar a recuperação anestésica, por sua vez feminina em seu estômago e desligar o isoflurano. Mantendo a face do animal dentro do aparelho de respiração, por sua vez de oxigênio até 3% para ajudar a recuperação da anestesia. O animal deve ser colocado em uma gaze limpa e seca em cima da almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. </li><li> Enquanto o animal está grogue, injetar 2 mL da solução de Ringer via subcutânea, sob a pele do animal no pescoço. </li><li> Continue segurando o animal sob fluxo de oxigênio por vários minutos e compressas de gaze aquecimento, a fim de despertar o animal. Ciclos curtos de movimento do animal deve ser observado como ele retorna a um padrão de respiração normal. Observe por alguns minutos até animal parece consciente e acordado. </li><li> Pulverizador abdômen da fêmea com Gentamicina spray e enrole o animal em uma gaze esterilizada. </li><li> Transferência do animal em uma gaiola estéril com cama autoclavado e habitação de papelão. </li><li> Garrafas de água devem ser cuidadosamente limpos, esterilizados e preenchido com água estéril. A 500 mL de água adicionar 2 mL de antibiótico sulfametazina (25% de ações). </li><li> Administrar a buprenorfina 0,05 mg / kg por via subcutânea após a cirurgia pela manhã. </li><li> Monitorar de perto a fêmea durante as primeiras 24 horas pós-cirurgia. Se os animais são mantidos mais de 24 horas, as fêmeas são transferidas para novo stergaiolas ile no dia 2. </li></ol> 9. Resultados representante Neocórtex O neocórtex é a região do sistema nervoso central que é responsável pelo visual e processamento sensório-motor e maior funcionamento cognitivo. É composto por neurônios de projeção glutamatérgica e GABAérgica interneurônios que são derivados do telencéfalo dorsal e ventral, respectivamente. Para lidar com os papéis de genes diferentes no desenvolvimento neocortical, que usamos em eletroporação utero, quer misexpress ou bloquear a expressão (ou seja, através da utilização de shRNA construções) de genes diferentes na telencéfalo dorsal ou ventral 1,3,4. Para misexpress genes no telencéfalo de embriões, nós usamos um vetor de expressão bicistronic (pCIG2), contendo um promotor CMV-βactin-enhancer e um local de entrada interna ribossomo (IRES) avançada proteína fluorescente verde (EGFP, em pCIG2) cassete, permitindo transfectadas células para ser detectada por epifluorescência (Fig. 2A-C). Nós usamos essa tecnologia para introduzir construções expressão no telencéfalo de E11.5 a E15.5 (dados apresentados está em E12.5;. Fig. 2). Ao permitir que os embriões a desenvolver vários dias pós-eletroporação, somos capazes de controlar a diferenciação e migração de GFP-rotulados progenitores. À medida que o de diferenciação, 3 dias após a eletroporação-GFP + células se diferenciam e migram para fora da zona ventricular (vz), zona subventricular (SVZ) e zona intermediária (iz) e na placa cortical (cp;. Fig 2C). Se cérebros electroporated na E12.5 são analisados ​​após 24 horas, podemos monitorar eventos no início da maturação e migração neuronal progenitor por co-rotulagem com marcadores de células progenitoras apical (ie, Pax6;. Fig. 2A), progenitores basal (ie, Tbr2; . Fig. 2B) e pós-mitóticos neurônios neocorticais (ie, Tbr1;. Fig 2C). Diencéfalo O hipotálamo está na base ventral do SNC e funciona como um gateway entre os sistemas endócrino e sistema nervoso autônomo. Durante o desenvolvimento, a múltiplos núcleos que compõem o hipotálamo madura diferenciar de uma zona progenitor comum que as linhas da região ventral-a maior parte do diencéfalo embrionárias. Atualmente, as vias moleculares que regulam a proliferação de células progenitoras, diferenciação neuronal ea formação de núcleos hipotalâmicos são mal compreendidos. Usamos eletroporação in utero para atingir a expressão do gene repórter para o diencéfalo embrionárias através da injeção de DNA para o 3 º ventrículo de E12 embryos.We seguido da distribuição de GFP na diferenciação de neurônios no E14. Com esta metodologia, conseguimos alvo expressão GFP para o tálamo, pré-tálamo eo hipotálamo (Fig. 3A). Análise de cortes coronais revela que conseguimos alvo expressão GFP para células progenitoras que zona da linha do ventrículo do 3 º ventrículo e neurônios que migram para fora da zona do manto para formar núcleos (Fig. 3B) Retina A retina é a camada neural do olho, responsável pela conversão de fótons de luz em impulsos elétricos transmitidos ao cérebro. Se desenvolve como um outpocketing do diencéfalo embrionárias e, portanto, é derivado do tubo neural. A retina neural desenvolve a partir de um compartimento progenitor apical que se encontra adjacente ao espaço sub-retiniano, uma cavidade que separa os olhos do mesênquima cabeça. Segmentação construções de DNA para progenitores da retina, portanto, requer que as injeções são feitas em uma área-alvo de pequeno porte. Usando micromanipuladores, conseguimos com sucesso alvo desta pequena área em embriões de E13.5 a E15.5 (mostrado é E15.5 electroporations de PCIC com o repórter mCherry; Fig. 4.). Se retinae electroporated são examinados 24 horas pós-transfecção, observamos que a maioria das células + mCherry estão localizadas na camada externa neuroblastos (onbl), onde estão localizados dividindo progenitores, e não na camada de células ganglionares da retina (GCL; imagem ampliada), onde as células pós-mitóticas localizar. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Introdução à eletroporação in utero set-up e metodologia. (A) Os principais componentes do cirúrgica set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor (1), Narishige micromanipulador com suporte da agulha (2), Leica steromicroscope (3), fibra ótica de iluminação sistema (4), ECM 830 Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos (5) e almofada de aquecimento (6). (A &#39;) O animal é anestesiado com um vaporizador de anestésico isoflurano. (B, B &#39;) Resumidamente, após a anestesia, os cornos uterinos estão expostos e DNA misturado com verde rápido é injetado no cérebro vesículas embrionárias. A injeção de sucesso é visualizado através do rastreamento do jejum verde corante (B &#39;). (C, C &#39;) Depois que o DNA é injetado com sucesso, os eletrodos são colocados pá de cada lado do útero, positioning o embrião para que o DNA será puxado em direção ao pólo positivo para a região do cérebro de escolha. (D, D &#39;) Uma vez que todos os embriões são injetados desejado, o útero é empurrado de volta para o abdômen (D), o peritônio é suturada, ea pele é grampeado (D&#39;). A fêmea grávida é então tempo para se recuperar e os filhotes electroporated são coletados nos pontos de tempo desejado. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Exemplo representativo de eletroporação telencefálico dorsal. (AC) Fotomicrografia de uma secção coronal através de um telencéfalo dorsal E13.5 electroporated em E12.5 com pCIG2. Electroporated células GFP + são analisados ​​para a sua expressão de marcadores de células progenitoras apical (Pax6 +, vermelho, A), progenitores basal (Tbr2 +, vermelho, B) e neurônios pós-mitóticos (Tbr1 +, vermelho, C). placas, cp cortical; SVZ, zona subventricular, vz; zona ventricular. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Exemplo representativo de eletroporação diencefálica. (A) Uma visão de um ventral do cérebro E14 que tem sido electroporated no E12 com pCIG2. GFP epifluorescência é visível no tálamo, pré-tálamo eo hipotálamo, demonstrando a propagação do plasmídeo pCIG2 microinjeção ao longo do 3 º ventrículo. (B) Fotomicrografia de secção coronal através do cérebro electroporated, mostrando a migração de células GFP + fora da zona ventricular e na zona do manto, onde núcleos hipotalâmicos irá se formar. 3V ventrículo, em terceiro lugar; T, tálamo; Hy, hipotálamo; mz, manto zona; Tel, telencéfalo; Pret, prethalamus; vz, zona ventricular. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Exemplo representativo de eletroporação da retina. Secção coronal através de um olho E16.5 electroporated com PCIC na E15.5 mostrando o acúmulo de células mCherry + na camada de neuroblastos exterior e não no Brn3b + células ganglionares da retina na camada de células ganglionares. A inserção é uma imagem de maior ampliação da área de box. GCL, camada de células ganglionares da retina; le, lente; onbl, camada neuroblasto exterior; re, retina.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Eletroporação in utero pode ser usado para analisar uma ampla variedade de processos de desenvolvimento. Por exemplo, a transfecção de genes repórter, como GFP, mCherry ou fosfatase alcalina pode ser usado para conduzir linhagem rastreamento e experiências de migração neuronal. Alternativamente, Cre recombinase pode ser transitoriamente expressa seletivamente eliminar um alelo floxed em um espacialmente e / ou temporalmente controlada maneira. Além disso, shRNA ou dominante constrói negativo pode ser ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Categoria </th></tr><tr><td> Tesoura fina </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Iris tesoura, curvas </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Porta Agulha Ex-Delicate </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Anel de fórceps, 9mm </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Olho vestir Pinça </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Pinça </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Pinça </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Tecidos fórceps-Adson </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Reflex Aplicador Clipe </td><td> Instrumento de precisão mundo </td><td> 500343 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Colher perfurada, 15 mm de diâmetro </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Remover Autoclip </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> De seda preta trançada Suture </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Reflexo da pele fechamento da ferida inoxidável Aço Clips </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 500346 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> ECM 830 Praça Sistema de Eletroporação Onda </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinças w / Variável Gap Round 2 Eletrodo Placa 5 milímetros Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinças w / Variável Gap Round 2 Eletrodo Placa 7 milímetros Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet microinjetor </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Controle pé para Eppendorf FemtoJet microinjetor </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Modelo Cleaner Bransonic ultra-1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952-118 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipeta Puller </td><td> Sutter Instrumento, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipetas - borosilicato com filamento OD: 1mm, ID: 0,78 mm, 10 cm de comprimento </td><td> Instrumento Sutter </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> 3 Axis-Manipulator Grosso </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Dispositivo de fixação magnética para micromanipulador </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> M1 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Aço Base Plate para micromanipulador </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 5052 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Titular micropipeta </td><td> Pr mundoInstrumentos ECISÃO </td><td> MPH3 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta Handle </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 5444 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Vaporizador de anestésico isoflurano </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODELO 100-F </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Metriclean2 solução pouca espuma para sonicando instrumentos cirúrgicos </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml em 0,2 g de spray azul de metileno de antibióticos após a sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Germex para esterilizar instrumentos cirúrgicos </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> BNP pomada oftálmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuído por Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> comercialmente disponíveis </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Stanhexidine limpador de pele 4% w / v </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Buprenorfina analgésico (Temgesic) </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; de antibióticos orais sulphamethazine </td><td> Professional Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Solução de Ringer com lactato </td><td> Baxter Corporação </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Saline - cloreto de sódio a 0,9% </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Inalação Anestésica - USP isoflurano </td><td> Parceiros farmacêutica do Canadá Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

A capacidade de manipular a expressão genética é a pedra angular da moderna embriologia experimental dias, levando para a elucidação de múltiplas vias de desenvolvimento. Vários poderosos e bem estabelecida tecnologias transgênicas estão disponíveis para manipular os níveis de expressão gênica no mouse, permitindo a geração de ambos os perda e ganho de função-modelos. No entanto, a geração de transgênicos do mouse é tanto caro e demorado. Métodos alternativos de manipulação genética, portanto, sido amplamente procurado. In utero eletroporação é um método de entrega de genes em embriões de ratos vivem 1,2 que temos adaptado com sucesso 3,4. É em grande parte baseada no sucesso de tecnologias na eletroporação in ovo que são comumente usados ​​em pinto 5. Resumidamente, o DNA é injetado no ventrículos aberta do cérebro em desenvolvimento ea aplicação de uma corrente elétrica provoca a formação de poros transitórios na membrana celular, permitindo a absorção de DNA na célula. Em nossas mãos, os embriões podem ser eficientemente electroporated logo dia embrionário (E) 11,5, enquanto a segmentação de embriões mais jovens exigiria uma ultra-sonografia protocolo de microinjeção, como descrito anteriormente 6. Por outro lado, E15.5 é a última fase, pode facilmente electroporate, devido ao aparecimento de parietal e diferenciação osso frontal, o que dificulta microinjeção no cérebro. Em contraste, a retina é acessível através do fim da embriogênese. Embriões podem ser coletados em nenhum momento durante o período embrionário ou pós-natal precoce. Injeção de uma construção repórter facilita a identificação de células transfectadas. Até à data, em eletroporação utero tem sido mais utilizado para a análise do desenvolvimento neocortical 1,2,3,4. Estudos mais recentes têm como alvo a retina embrionária 7,8,9 e tálamo 10,11,12. Aqui, apresentamos uma modificação no útero protocolo de eletroporação que pode ser facilmente adaptado a diferentes domínios alvo do SNC embrionárias. Nós fornecemos evidências de que usando esta técnica, podemos atingir o embrionárias telencéfalo diencéfalo e retina. Resultados representativos são apresentados, primeiro mostrando o uso desta técnica para introduzir DNA construções de expressão para os ventrículos laterais, o que nos permite monitorar a maturação de células progenitoras, diferenciação e migração no telencéfalo de embriões. Também mostramos que esta técnica pode ser usada para DNA-alvo para os territórios diencefálica em torno do 3 º ventrículo, permitindo que as rotas migratórias de diferenciar neurônios em núcleos diencefálica a ser monitorado. Finalmente, nós mostramos que o uso de micromanipuladores nos permite com precisão introduzir DNA construções em áreas-alvo de pequeno porte, incluindo o espaço sub-retiniano, permitindo-nos analisar os efeitos de manipular a expressão genética no desenvolvimento da retina.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

efficient-gene-delivery-into-multiple-cns-territories-using-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

19.7K visualizações.  University of Calgary. Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Neurociência

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC<i&gt; via</i&gt; Artéria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...