Agradecemos a Emily A. Kelly para o design da placa cabeça. Estamos gratos pelo apoio de prêmios NIH para HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 eo apoio generoso do Fundo de Neurologia Pediátrica Geoffrey Waasdorp sem a qual este trabalho não teria sido possível. AKM é financiado pelo NIH (EY019277), Fundação Whitehall, o Alfred P. Sloan Foundation e um prémio de carreira em de Ciências Biomédicas da Burroughs Wellcome Fund. MET é financiado por um de Fonds la recherche en sante du Quebec (FRSQ) prêmio de treinamento pós-doutorado. DFM é um estagiário no Programa de Formação Médica Scientist, financiado pelo NIH T32 e T32 GM07356 AI049815.

1. Preparando o animal for Imaging <ol><li> Em nossos experimentos, usamos adulto CX 3 CR 1 camundongos GFP / + que expressam GFP em linhagens de células mononucleares, incluindo microglia. Quatro cepas diferentes de camundongos podem ser usados ​​para atender as necessidades de um projeto específico. </li><li> Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de um coquetel de drogas três consistindo de 0,05 mg / kg de fentanil, 5,0 mg / kg midazolam e 0,5 Medetomidine mg / kg. 5 preparação cirúrgica para TSCW começa depois que o animal já não responde a estímulos dolorosos, como como uma pitada de cauda. Durante toda a cirurgia e de imagem, podemos manter o animal em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia pós-anestésica. Se necessário, uma dose de reforço de um terço da dose original do cocktail anestésico pode ser dada para restaurar o plano anestésico original. </li><li> Cobrir os olhos do animal com uma pomada oftálmica de proteção para manter os olhos úmidos durante a anestesia, que suprime reflexo do animal piscar. Remover os pêlos do couro cabeludo do animal usando uma navalha, tesoura, tesoura, ou métodos químicos. Desinfectar o couro cabeludo usando a 10% de solução de iodo-povidona e álcool 70%. Todos os instrumentos cirúrgicos precisam ser autoclavado, esterilizado com um esterilizador de bolas de gude, ou desinfetados com álcool 70%. </li><li> Faça uma incisão na linha média do couro cabeludo com uma tesoura pequena, começando 4-5 mm caudal ao crânio e avançando para a frente a frente dos olhos. É importante que esta incisão ser longa o suficiente para que a pele não irá interferir com a colagem da chapa de cabeça que é usado para estabilizar a cabeça de rato durante dois fótons de imagem (Figura 1). Identificar a área a ser diluído em um escopo de dissecação. Evitar áreas de interesse localizado directamente sobre suturas cranianas, como o crânio é menos estável nessas áreas e subjacentes grandes vasos e meninges irá interferir com a imagem. </li><li> Aplicar o etanol 100% seguido pela solução de 10% de cloreto férrico com um cotonete estéril para secar as membranas no topo do crânio e raspar-los usando uma pinça fina ou uma lâmina de barbear. A não remoção dos resultados membranas em anexo instável cabeça prato. </li><li> Coloque uma fina camada da cola 910 Permabond em torno das bordas da janela de visualização por baixo da placa de cabeça. Coloque o prato a cabeça coberta com cola sobre a área de interesse no crânio do animal com uma leve pressão (Figura 1). É importante que a placa de cabeça é apenas colado ao osso do crânio. Toda a pele ou membranas que estão presos entre a placa de cabeça e do crânio vai diminuir a estabilidade do vínculo. Aplique uma pequena quantidade de acrilato de volta a janela de visualização usando uma seringa para instantaneamente cola forte o laço. Finalmente, aplique uma pequena quantidade de Loctite 454 para as bordas da janela de visualização para evitar vazamentos. </li><li> Parafuso da placa de cabeça para o titular animal (Figura 1) e verificar a estabilidade da placa de cabeça sob um escopo dissecção por sondagem levemente com um par de fórceps. Não deve haver nenhum movimento do crânio em relação à placa cabeça. Coloque uma gota de solução salina sobre a janela de visualização para garantir que não haja vazamentos. </li></ol> 2. Preparando a janela de Crânio afinado Cortical <ol><li> Em preparação para o desbaste do crânio, o crânio seco, utilizando uma combinação de cotonetes estéreis e ar comprimido. Inicialmente fina do crânio com uma broca estéril IRF 007 em uma broca II Microtorque fixada em 4000 rpm. Muito gentilmente, comece diluindo uma área de 2-2,5 mm de diâmetro circular do crânio. Use apenas a luz movimentos arrebatadores quase paralelo ao crânio; usar nenhuma pressão direta descendente. Parar de perfuração a cada 20-30 segundos para remover o pó de osso usando o ar comprimido. Estas pausas na perfuração de permitir que o crânio para esfriar para que não haja danos causados ​​pelo calor induzida ao tecido cerebral subjacente. <ol class="lalpha"><li> Como a perfuração avança, notar a transição para a camada de osso esponjoso úmido (ou seja, o &quot;díploe&quot;). Uma vez que esta camada é atingido, cuidado extra com a broca. </li></ol></li><li> Ocasionalmente verificar a espessura do crânio, colocando soro fisiológico sobre a área de desbaste e visualização no âmbito de dissecação. Solução salina fim de permitir a dissipação de calor. Como o crânio é diluído, menor vasculatura se torna visível. </li><li> Use uma MicroBlade estéril dental para alcançar a final de desbaste em solução salina, como o MicroBlade fornece um feedback muito mais tátil sobre a estabilidade do crânio. Isto permite uma preparação muito mais fino do que com a broca sozinho. A partir de nossa experiência, a espessura do crânio ideal é 10-30 mM. <ol class="lalpha"><li> É importante verificar a espessura do crânio sob epifluorescência várias vezes durante as primeiras tentativas em fazer uma janela de crânio fino. A nitidez ea profundidade da microglia visível e vasculatura dão uma boa indicação de quando a janela está pronta para a imagem latente. </li></ol></li><li> Quando a janela está pronto, cola um pedaço custom-made retangular de # 0 lamela wi<html> ª uma dimensão inferior a 2 mm de cada lado sobre a janela. Usando uma pipeta de vidro 1,0 milímetros de diâmetro, coloque uma pequena gota de cola de cianoacrilato sobre a área do crânio diluído e cuidadosamente mais abaixo, no pequeno pedaço de lamínula, em seguida, pressione suavemente contra o crânio para espremer excesso da cola. É importante para evitar a formação de bolhas entre o vidro ea cola já que o ar aprisionado fará com que a área sob a tornar-se opticamente opaca. A cola de cianoacrilato é usado porque ele permanece transparente quando seca e também evita óssea e regeneração da membrana mantendo o crânio sob a janela fina e translúcida. Se há alguma cola em cima da tampa de vidro, use o MicroBlade para remover cuidadosamente uma vez a tampa de vidro está no lugar e que a cola está seca. </li><li> Um analgésico (por exemplo, a Buprenorfina 2 mg / kg sub-cutânea) é administrado imediatamente após a cirurgia e re-administrada em qualquer sinal de dor, incluindo relutância em se movimentar, comer ou beber, perda de peso, salivação, piloereção, sons respiratórios, etc </li></ol> 3. Dois fótons de imagem <ol><li> Em preparação para dois fótons de imagens, cobrir o TSCW com solução salina e localizar a área de interesse sob epifluorescência (Figura 2). Para habilitar a imagem posterior da área, tirar uma foto com uma câmera fotográfica. </li><li> Por dois fótons de imagens, usamos uma custom-made microscópio de dois fotões 6, com um Ti: Sapphire a laser sintonizado nm 920. Fluorescência é detectada por meio de um tubo fotomultiplicador em todo o campo modo de detecção e um filtro de emissão 580/180. A lente de 20X imersão em água (0,95 NA) é usado durante toda a sessão de imagens. A potência máxima da potência do laser para o objetivo está definido entre 50 e 65 mW. </li><li> Selecione uma área de interesse em camadas cortical I ou II (até 150 M abaixo da superfície pial). Para facilitar a re-imagem, tirar fotos do mesmo campo de visão em 1X, 2X, 3X e zoom digital. Vasos sanguíneos podem servir como pontos de referência para mais facilmente encontrar o mesmo campo de visão durante as sessões de imagem subseqüentes. De acordo com um zoom de 3X, várias pilhas com z-80-90 Z-passos em cada pilha e um passo mM 0,69 podem ser adquiridos a cada 5 minutos até 30 minutos, o que permite uma boa amostragem da morfologia da microglia e comportamento ao longo do tempo ( Figura 3). Entre as aquisições de z-stacks, deve-se verificar o nível de solução salina sobre a TSCW, bem como a profundidade do animal de anestesia. </li></ol> 4. Injeção da neurotoxina HIV-1, Tat <ol><li> Primeiro, silanizadas o revestimento interno de uma agulha de calibre 35 e seringa de 10 mL Microvolume para evitar deposição de Tat. Retirar a solução silanizing (Sigmacote) até encher tanto a agulha e seringa. Deixar a solução descansar por 5 minutos em temperatura ambiente. Esvaziar a solução da seringa, retire o êmbolo, e permitir que a seringa ea agulha para secar completamente. Finalmente, lave a seringa ea agulha cuidadosamente com água deionizada. </li><li> Realizar uma pequena craniotomia 0,5 mm de diâmetro ou três milímetros rostral ou lateral para o TSCW onde dois fótons imagens foram obtidas, usando um pouco menor broca e com cuidado afinando o crânio até um par de fórceps com pontas afiadas podem remover a camada diluída de osso-se facilmente. Nós usamos uma seringa de 10 mL Microvolume equipado com agulha de calibre 35 controlado por uma bomba de seringa Ultramicropump III montado em um micromanipulador de 3 eixos e depois alinhando a ponta da agulha para a craniotomia, é cuidadosamente avançados a uma profundidade de 700-900 mM abaixo a superfície pial onde 3 mL Tat 1-72 (ou outros agentes pró-inflamatórios) ou salina (ou veículo de controle) é entregue a 80 nL / min. </li></ol> 5. Alojamento dos animais <ol><li> Se o animal está a ser trabalhada várias vezes em um único dia, cobrir a área aberta do crânio com uma mistura de vaselina e pomada oftálmica para evitar desconforto ou danos ao crânio entre as sessões de imagem. Desligue a ponte o apoio da pequena cabeça-placa (ver Figura 1B) e colocar o animal em uma gaiola com o alimento aquecido facilmente acessível e água. Todos os animais devem ser alojados individualmente após a cirurgia em todos os momentos. Uma vez que as sessões de imagem para um animal são completas para um determinado dia, retire cuidadosamente toda a cabeça de chapa e sutura na pele para trás sobre o crânio com # 6 ou menor de sutura. Mais uma vez, abrigam os animais individualmente com alimentos de fácil acesso e água entre os dias experimental. Verifique diário dos animais para todos os sinais de estresse, dor ou infecção. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Estabilização do animal para cirurgia e de dois fótons de imagem (A) e design cabeça de chapa (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. GFP-rotulados microglia visualizado com epifluorescência. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. GFP-rotulados microglia visualizado com dois fótons de imagem após a implantação do TSCW, aproximadamente 50 mm abaixo da superfície pial. O single de dois fótons seções tomadas 15-30 minutos após o implante da TSCW (dia 0), bem como 7 e 17 dias depois, demonstrar que as janelas fica clara quando microglia permanecem inativados na ausência de insultos inflamatórios. O z-projeções tomadas 6 e 24 horas pós-injeção da neurotoxina HIV tat exibem impressionante alterações morfológicas da microglia ativada. Barra de escala: 10 mM.

<ol>
	<li>Mostany, R., &amp;amp, P. o. r. t. e. r. a. -. C. a. i. l. l. i. a. u., C, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., &amp;amp, Y. u. s. t. e., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li><li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system.">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li><li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp;amp, B. a. l. c. e. r. z. y. k., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia.">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li><li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp;amp, Q. u. i. n. l. a. n., M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders.">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li><li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp;amp, U. p. e. n. d. e. r., B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder.">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li><li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp;amp, M. c. A. r. t. h. u. r., C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain:+correlations+with+dementia.">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Há um consenso crescente de que o substrato real para HIV-1 déficits cognitivos associados (mão) é a destruição da arquitetura sináptica, presumivelmente causado por mediadores pró-inflamatórios liberados a partir de HIV-1 infectados fagócitos mononucleares. Ativação da microglia, células gigantes multinucleadas, e gliose devido à hipertrofia astrocitária são considerados inespecíficos marcas de HIV-1 infecção e inflamação nos 7 CNS. Em contraste, a gravidade da doença neurológica pré-mortem tem sido correlacionada com a perda de complexidade sináptica, bem como ônus de macrófagos na 8,9,10,11 CNS. No entanto, as interações dinâmicas entre microglia, infiltração de macrófagos periféricos e os neurônios de pacientes com HAND simplesmente não pode ser modelada utilizando o processamento estáticos convencionais obtidos a partir de estudos imunocitoquímicos convencionais. Estudos recentes de nosso laboratório sugerem que pelo menos algumas dessas interações entre periférico e central células mononucleares e os neurônios podem ser modelados em parte pela injeção estereotáxica do HIV-1 proteína Tat 1-72 em parênquima cerebral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, e Gelbard, dados não publicados). Por isso, decidiu aplicar in vivo de imagens de dois fótons para examinar a interação entre macrófagos derivados de monócitos, micróglia residente cérebro e neurônios, em um modelo animal dócil pequeno para neuroAIDS. Enquanto os preparativos crânio-aberto ou diluído crânio-pagar um exame único de arquitetura cortical por um breve período de tempo (horas), os investigadores interessados ​​no curso de tempo de eventos subaguda não pode usar estas preparações sem artificialmente a ativação da microglia / macrófagos devido à manipulação cirúrgica de a janela calvária. Aqui nós demonstramos uma forma simples de contornar estas limitações colando um pequeno pedaço de lamínula de vidro sobre a área crânio diluído impedindo a regeneração da calvária no TSCW bem como a manutenção translucidez para ≥ 3 semanas. Nós ainda demonstrar que esta técnica nos permite monitorar o comportamento dos monócitos periféricos que entram microvasculatura cerebral, bem como cérebro microglia residente em resposta à injeção estereotáxica de HIV Tat 1-72 no córtex de camundongos heterozigotos para CX 3 CR 1 / GFP ( para identificar as células da linhagem mononuclear). Esta técnica pode ser facilmente adaptado para uso em camundongos com diferentes origens genéticas, por exemplo, que usam rotineiramente heterozigotos CX 3 CR 1 / X GFP Thy-1 YFP 12 camundongos para investigar as interações entre macrófagos derivados de monócitos, micróglia residente cérebro e neurônios em modelos in vivo de neuroinflamação relevantes à mão. Nossa preparação TSCW permite que pesquisadores para estudar interações célula-célula entre a periferia eo SNC que podem ocorrer em períodos de semanas, no qual o animal pode ser repetidamente fotografado antes e após tratamento experimental. Assim, cada animal pode servir como seu próprio controle. Uma ressalva para este modelo TSCW é que as células-alvo sob investigação devem ser geneticamente modificados para expressar melhor as proteínas fluorescentes (eXFP) ou ser rotulados com um corante fluorescente sem violação mecânica da calvária, e que a expressão eXFP deve ser robusta o suficiente para permitir arquitetura celular a ser visualizados após sessões de imagem repetida durante um período de semanas.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

Tradicionalmente, na neurociência, in vivo dois fótons imagem do sistema nervoso central de murinos tem ou envolveu o uso de crânio aberto 1,2 ou diluído crânio-3 preparativos. Enquanto a técnica do crânio aberto é muito versátil, não é ideal para estudar microglia porque é invasivo e pode causar a ativação da microglia. Mesmo que a abordagem crânio-diluído é minimamente invasivo, o re-repetido afinamento do crânio necessárias para imagens crônica aumenta os riscos de lesão tecidual e ativação da microglia e permite um número limitado de sessões de imagem. Aqui apresentamos um método janela crônica crânio-fino para monitoramento microglia murino in vivo durante um período prolongado de tempo usando dois fótons de microscopia. Demonstramos como preparar um estável, acessível, janela diluído crânio-cortical (TSCW) com uma lamela de vidro translúcido apposed que permanece ao longo de três semanas de observação intermitente. Esta preparação é muito mais TSCW imunologicamente inerte com relação à ativação da microglia de craniotomia aberta ou crânio repetidas desbaste e permite um número arbitrário de sessões de imagem durante um período de semanas. Nós preparamos TSCW em CX 3 CR 1 GFP / 4 + camundongos para visualizar microglia com a proteína verde fluorescente melhorada para ≤ 150 M abaixo da superfície pial. Mostramos também que esta preparação pode ser usado em conjunto com injeções cerebral estereotáxica da proteína HIV-1 Tat neurotóxicos, ao lado do TSCW, que é capaz de induzir microgliosis duráveis. Portanto, esse método é extremamente útil para analisar mudanças na morfologia e motilidade microglial ao longo do tempo no cérebro vivo em modelos de HIV Disorder Associated neurocognitivos (de mão) e outras doenças neurodegenerativas com um componente neuroinflamatórias.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Nós descrevemos um método para visualizar repetidamente microglia murino e monócitos circulantes<em&gt; In vivo</em&gt; Durante horas, dias ou semanas usando microscopia de dois fótons transcraniana. Demonstramos como preparar uma janela diluído crânio-que permite a observação intermitente de microglia quiescentes que podem ser ativadas por meio de injeção estereotáxica adjacentes do Tat do HIV-1 proteína reguladora.

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K visualizações.  University of Rochester. Nós descrevemos um método para visualizar repetidamente microglia murino e monócitos circulantes In vivo Durante horas, dias ou semanas usando microscopia de dois fótons transcraniana. Demonstramos como preparar uma janela diluído crânio-que permite a observação intermitente de microglia quiescentes que podem ser ativadas por meio de injeção estereotáxica adjacentes do Tat do HIV-1 proteína reguladora.

Vídeo: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...