Este estudo foi apoiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation conceder 5-2007-97 (a VEP), pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais concede R01DK064973 (a VEP), R01DK48494 (para LHP), T32DK07074 (apoio SCE), K01DK083552 (para MDK), e por P60DK20595 para a Universidade de Chicago e Diabetes Research Training Center. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIDDK ou o NIH.

1. Pré-injeção Preparações <ol><li> Rápido o peixe por pelo menos 24 horas antes da injeção. Isto irá esvaziar o bulbo intestinal (estômago) conteúdo. O protocolo de jejum básica é a de transferir o peixe, a sua densidade normal, para um tanque limpo, então reter o alimento. Para longo prazo jejum que exigir condições mais rigorosas (por exemplo, para estudos de glicose no sangue), ver considerações adicionais na discussão. </li><li> Prepare Cortland solução salina (Perry et al., 1984). Para um volume de 100 mL, dissolver o seguinte em água destilada: 725 mg de NaCl (124,1 mM) 38 mg KCl (5,1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mM) 24 mg MgSO 4 7H 2 O ∙ (1,9 mM) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mM) 100 mg NaHCO 3 (11,9 mM) 4 g Polivinilpirrolidona (PVP) (4%) 1000 unidades de Heparina USP Filtro, esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare o microscópio. <ul><li> Cobrir a base do microscópio com filme plástico para proteção em caso de derramamentos. </li><li> Coloque uma toalha de papel em cima do plástico. A mesa cirúrgica vai sentar em cima da toalha de papel. </li><li> Pré-ajustar o foco através da visualização da mesa cirúrgica e incidindo sobre a esponja. </li></ul> Dica: Coloque o seu dedo em cima da esponja e focar isso. Isto irá eliminar ou minimizar ainda mais o ajuste focal uma vez que o peixe está na mesa cirúrgica. </li><li> Pesar o peixe. <ul><li> Encher um copo de 500 ml cerca de 1 / 3 cheio com água instalação de peixe. </li><li> Tare a balança. </li><li> Recolher o peixe usando uma rede. Wick o excesso de água longe da net e peixes, por breves instantes dabbing o líquido sobre papel absorvente. Transfira o peixe para o copo. </li><li> Pesar o peixe. </li><li> Transferir os peixes para um tanque limpo. </li><li> Transferência de cada peixe pesava a seu próprio tanque rotulados. </li><li> Calcular o volume de injeção para cada peixe com base no peso dos peixes. </li></ul></li><li> Prepare a seringa e equipamento de injeção relacionados. Injectável, recomendamos uma 35G agulha de aço chanfrada a 10 micro e NanoFil mL. Prepare a seringa NanoFil e tubos silflex seguindo as instruções do fabricante. É importante para eliminar as bolhas da seringa e tubos. Após o preenchimento da seringa e tubulação, monte a seringa na bomba, e programar o volume de injeção para o primeiro peixe. </li><li> Prepare a mesa cirúrgica. <ul><li> Cortar uma esponja macia (como # L800-D, Jaece Industries), de modo que é de aproximadamente 20 mm de altura. Na face plana, faça um corte que é de 10-15 mm de profundidade. Este corte é a calha que vai segurar o peixe para injeção. </li><li> Definir a esponja em uma placa de Petri 60 mm. </li><li> Definir a placa de Petri com esponja em uma de dimensões adequadas e tampa da caixa ponta da pipeta. A tampa precisa ser grande o suficiente para armazenar água para ajudar a manter a temperatura esponja, mas deve ser rasa o suficiente para não ficar no caminho. Usamos uma tampa de uma caixa de ponta P200 que é 11,4 centímetros L x 7,7 centímetros W x 1.5 cm D. </li></ul> Estes três itens reunidos (esponja em placa de Petri na tampa da caixa) constituem a mesa cirúrgica. </li><li> Prepare o anestésico. <ul><li> Fazer gelo picado usando cubos feitos de água instalação de peixe. </li></ul> Dica: Usando bandejas do cubo de gelo típico, vai demorar 3 bandejas para anestesiar 12/10 peixe. <ul><li> Encher um balde de gelo limpo com o gelo picado. </li><li> Colocar a mesa cirúrgica em um recipiente maior, como um Rubbermaid 2,4 litros recipiente de armazenamento de alimentos. </li><li> Despeje um pouco de água facilidade (quente) para o recipiente externo e mesa cirúrgica. Manter uma reserva de água quente instalações nas proximidades. </li><li> Coloque um termômetro dentro do recipiente externo. </li></ul></li></ol> 2. Injeção de anestesia e recuperação <ol><li> Coloque o recipiente anestésico exterior com mesa cirúrgica ao lado do microscópio. Tem o balde de cubos de gelo nas proximidades. </li><li> Traga a temperatura da água até 17 ° C pela adição de pedaços de gelo. Importante: Não vá abaixo dos 17 ° C para esta etapa. </li><li> Use uma rede para transferir o peixe para o recipiente exterior. </li><li> Lentamente, adicionar pedaços de gelo ao recipiente para baixar a temperatura a 12 ° C, ao longo de vários minutos. </li><li> Monitorar o comportamento dos peixes: Aos 17 ° C ou ligeiramente abaixo, o peixe tipicamente espalhará seus nadadeiras peitorais horizontalmente, gasp, e tem movimentos rápidos opérculo. Quando a temperatura cai, os peixes vão nadar mais lentamente e, finalmente, parar de nadar. Como o plano cirúrgico de anestesia é abordado, ofegante vai parar e movimentos opérculo será lenta. O peixe está pronto para a injecção quando não reage a ser tratada. Para a maioria dos peixes, 12 ° C é suficiente. Peixes maiores podem exigir mais frio water. </li><li> Como a temperatura desejada é atingida (~ 12 ° C ou mais frio), pressione a esponja para saturá-lo. </li><li> Mantenha seus dedos na água fria o suficiente para que eles não vão aquecer o peixe e trazê-lo para fora de anestesia durante o manuseio. </li><li> Com dedos frios, gentilmente transferir o peixe para a calha da esponja. A posição do peixe com o abdômen para cima e as brânquias no cocho. </li><li> Transferir rapidamente da mesa cirúrgica para o palco microscópio. </li><li> Trabalhando rapidamente, insira cuidadosamente a agulha no midline entre as nadadeiras pélvicas. A agulha deve apontar cranialmente e ser inserido mais perto da cintura pélvica do que do ânus. Você deve ser capaz de sentir quando a agulha é profunda para a parede do corpo. Injetar o volume adequado e retire a agulha. </li><li> Após a injeção, transferir imediatamente os peixes de volta à sua água morna (~ 28.5 ° C) tanque de recuperação, libertando o peixe da esponja sobre a água do tanque. Dica: Se o peixe não começa imediatamente natação, ajudá-la a recuperar rodando suavemente água para as brânquias. </li><li> Verifique a agulha. Ocasionalmente, uma escala pode ser anexado e deve ser removido antes da próxima injeção. </li><li> Para injecções subsequentes, use água morna facilidade para trazer o anestésico temperatura da água câmara de volta até 17 ° C antes de introduzir os peixes próximos. </li></ol> 3. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Seguintes resultados Representante injeção intraperitoneal de 0,5 mg de glicose / g ou veículo. Peixes foram mantidos em jejum por 72 horas antes da injeção. O eixo x mostra o tempo, após a injecção. Média ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Injeção intraperitoneal envolve cinco etapas: jejum, pesagem, anestesia, injeção e recuperação. Para cada etapa existem melhores práticas que podem garantir o sucesso. Sucesso de um paciente inclui peixes saudáveis, bem como um bom resultado experimental. Jejum: Um jejum de 24 horas deve esvaziar o bulbo intestinal. Esta prática é tomada a partir da literatura veterinária peixe (eg, Brown 1993). As considerações adicionais de jejum são discutidos abaixo. Longo prazo jejum: Descobrimos que um jejum de 72 horas é necessária para diminuir a glicose no sangue a um nível de base antes da injeção (Eames et al, 2010).. Temos também descobriu que, para estudos de glicose existem vários procedimentos que são necessários para garantir que os peixes estejam em jejum corretamente. Comece com um tanque limpa (sem resíduos no fundo). Tanques deve ser desligada, claramente identificados como &quot;jejum&quot;, e em um local onde o pessoal de assistência entusiástica peixe não vai alimentá-los. Avaliar o ambiente externo do tanque e tomar medidas para evitar que os peixes de ser estressado de distúrbios, como estresse é conhecido por elevar a glicose no sangue (Chavin e Young, 1970;. Groff et al, 1999). Por exemplo, nós tivemos uma experiência de jejum em que uma rádio foi operado diariamente no banco que estava segurando os tanques de peixes. Descobrimos que a glicemia foi invulgarmente elevado e concluiu que os peixes estavam estressados ​​pelas vibrações. Outro estressor é a superlotação. Os peixes devem ser mantidos a uma densidade que está em conformidade com boas práticas de peixe. Para recomendações, consulte Marca et al. (2002) e Westerfield (1995). Temos tido bons resultados em jejum nossos peixes com uma densidade de 10-12 peixes em um tanque de 9 litros (com 3 camadas de mármores ocupar algum desse volume). Separar os sexos pode causar estresse, por isso recomendamos a manutenção de uma população mista de sexo durante o jejum. Isto significa que os ovos podem ser estabelecidas, e os ovos precisam ser seqüestrado para que eles não serão comidos. Uma maneira simples de sequestrar ovos é para cobrir o fundo do tanque com 2-3 camadas de bolinhas de gude. Qualidade da água precisa ser mantida através da remoção de ovos e resíduos e pela substituição de cerca de 10-15% da água do tanque, diariamente. Para a remoção de ovos e resíduos, sifão funciona bem. Pesagem: Na pesagem dos peixes que não são anestesiados, cuidados devem ser tomados para minimizar a transferência de água da rede para o copo, para assegurar uma medição precisa. Se o líquido (com peixes) é apagado em toalhas de papel, a maioria da água em excesso pode ser removido, eo peso podem ser medidos com precisão. Pode ser mais fácil para anestesiar os peixes antes da pesagem, mas não testei os possíveis efeitos de anestesiar um peixe duas vezes em um dia. Nós testamos a nossa técnica de pesagem do pescado pela primeira vez com a compensação / blotting método e, em seguida, voltando a pesar o peixe depois de ter sido anestesiados, e suavemente secos com papel absorvente. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa de peso entre os métodos (P = 0,7927, t-test). Além disso, testamos se essa compensação / blotting método de glicose no sangue afetadas, em comparação com simplesmente transferir o peixe para o copo assim que é saldada (sem blotting). Nós não encontramos nenhuma diferença significativa no nível de glicose no sangue entre os dois métodos de transferência (P = 0,2241, t-test). Anestesiar: anestesia química pode ser adequado para muitos estudos. Aqui nós temos demonstrado anestesia água fria como uma alternativa, porque muitos anestésicos (incluindo tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), aumentar a glicose no sangue. Em estudos anteriores, nós determinamos que a água fria não levanta de glicose no sangue em zebrafish (Eames et al., 2010). Para anestesia água fria, a temperatura deve ser reduzida lentamente. A taxa de diminuição parece depender do tamanho do peixe, com peixes menores indo mais rápido do que em peixes maiores. Após a injeção, você pode observar que o peixe está se recuperando muito lentamente da anestesia (veja abaixo). Isto pode ocorrer quando tanto a temperatura inicial é muito baixo, ou quando a temperatura diminui muito rapidamente. A temperatura de partida é muito baixo se o peixe se dobra lateralmente ao entrar na água. Se a temperatura inicial está correto, os peixes vão manter o seu equilíbrio inicialmente. Ele irá girar suas nadadeiras peitorais para uma posição horizontal, gasp, e tem movimentos rápidos opérculo. Normalmente, ele irá nadar. Como a temperatura diminui, os movimentos irão diminuir e os peixes vão perder o equilíbrio. Um plano cirúrgico de anestesia é alcançado quando os peixes podem ser manuseados sem reagir. Para manter os peixes sob anestesia cirúrgica, os dedos devem ser frias, por isso mantê-los na água antes de manusear o peixe. A esponja também deve ser mantido frio na mesma temperatura que a água usada para anestesiar os peixes. É importante para saturar a esponja com água que é sufficiently frio para manter a anestesia uma vez que o peixe é colocado sobre ele. Injecção: Antes de injeções empresa, você pode querer dissecar pelo menos um peixe para ter uma noção de espessura da parede do corpo. Isso pode ajudar você para julgar o quanto a agulha precisa inserir para entrar na cavidade abdominal. Além disso, ao inserir a agulha, você pode sentir a parede do corpo &quot;dar&quot; quando a agulha penetra na cavidade abdominal. Durante a injeção, tomar medidas para manter o paciente feliz. Certifique-se que a esponja está saturada com a água correta temperatura fria para evitar que o peixe de reavivar durante a injeção. Uma esponja bem macia saturada e é importante para minimizar os danos às escalas e muco cobertura da pele. Uma esponja bem saturada também é importante para manter as brânquias aerado. É altamente recomendável a esponja de espuma listados abaixo em Materiais. Finalmente, uma vez que o peixe é anestesiado, trabalhar rapidamente para minimizar o tempo que o peixe está sob. Recuperação: O peixe deve se recuperar da anestesia praticamente ao entrar no tanque de água quente. Se o peixe não começa imediatamente natação, rode suavemente a água para suas guelras para acelerar a recuperação. Se a recuperação é lenta, então o peixe passou sob muito rapidamente e você deve ajustar o procedimento de anestesia de forma adequada. As possíveis causas da lenta recuperação são discutidos sob anestesia.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

Um método conveniente para tratar quimicamente zebrafish é introduzir o reagente na água do tanque, onde será absorvido pelos peixes. No entanto, este método torna difícil saber o quanto de reagentes é absorvido ou tomado por peixe. Algumas perguntas experimental, particularmente aqueles relacionados aos estudos metabólicos, pode ser melhor abordados através da apresentação de uma quantidade definida para cada peixe, com base no peso. Aqui apresentamos um método para injeção (IP) intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Injeção é na cavidade abdominal, posterior à cintura pélvica. Este procedimento é uma adaptação de métodos veterinários utilizados para peixes maiores. É seguro, como temos observado mortalidade zero. Além disso, temos visto sangramento no local da injeção em apenas 5 de 127 injeções, e em cada um desses casos, o sangramento foi breve, durando vários segundos, ea quantidade de sangue perdido era pequeno. Sucesso com este procedimento requer manuseio suave dos peixes através de várias etapas, incluindo o jejum, pesagem, anestesia, injeção e recuperação. Precauções são necessárias para minimizar o estresse durante o procedimento. Nosso precauções incluem o uso de um volume de injeção de pequeno e uma agulha 35G. Usamos Cortland solução salina como o veículo, que é osmoticamente balanceada para peixes de água doce. Aeração das brânquias é mantida durante o procedimento de injeção pela primeira trazendo o peixe em um plano cirúrgico de anestesia, o que permite movimentos opérculo lento e, segundo, mantendo os peixes em um canal dentro de uma esponja saturada de água durante a injeção em si. Nós demonstrar a utilidade da injeção IP através da injeção de glicose e monitorar a elevação do nível de glicose no sangue e seu posterior retorno ao normal. Como o stress é conhecido por aumentar a glicose no sangue em peixes teleósteos, comparamos os níveis de glicose no sangue em adultos veículo injetado e não injetados e mostrar que o procedimento não causa um aumento significativo da glicose no sangue.

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Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Demonstramos injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Usamos a 10 mL NanoFil micro controlado por um controlador MICRO4 e III UltraMicroPump. Esta demonstração inclui o uso de água fria como um anestésico.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

57.0K visualizações.  The University of Chicago. Demonstramos injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Usamos a 10 mL NanoFil micro controlado por um controlador MICRO4 e III UltraMicroPump. Esta demonstração inclui o uso de água fria como um anestésico.

Vídeo: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...