Desejos RAW de agradecer aos membros da Zon e da pesquisa Davidson laboratórios para suas inúmeras contribuições para ajudar a desenvolver estratégias que têm vindo progressivamente a forma esta técnica de dissecação de peixe-zebra adulto ao longo da última década. Além disso, queremos expressar nossa gratidão aos membros do pessoal da Notre Dame Centro de Pesquisa Zebrafish para prestação de cuidados de manejo em curso excelente para a nossa colônia zebrafish. RAW obteve financiamento da investigação a partir da atribuição da subvenção NIH-NIDDK DK083512, e de laboratório generoso financiamento start-up da Universidade de Notre Dame.

1. Dissecção do rim zebrafish adultos a partir de uma amostra de animais unfixed <ol><li> Selecione um peixe-zebra adulto entre 3-6 meses de idade para dissecção. </li><li> Euthanize o peixe, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por cerca de 4-5 minutos, observando com cuidado para ver que as brânquias e parar de se mover o coração pára de bater. </li><li> Usando uma colher, retire o peixe do banho tricaina em uma pequena quantidade de solução, decantar a solução e gentilmente colocar o animal em uma toalha de papel. </li><li> Use uma tesoura afiada dissecção para remover a cabeça do animal, fazendo um corte logo atrás do opérculo branquial (Figura 1, Um caminho). Descartar a cabeça em um recipiente de resíduos de risco biológico. </li><li> Use a tesoura de dissecção para abrir o corpo do animal, fazendo uma longa incisão ventral, a partir da cabeça e terminando na cauda, ​​na base da nadadeira caudal (Figura 1, B caminho). </li><li> Remover os órgãos internos do animal usando um par de pinças de dissecção / forceps, e colocá-los no lixo de risco biológico. Tenha cuidado para não escovar a parede do corpo dorsal, pois este é o local do rim (Figura 2). Se você tiver selecionado um peixe fêmea, você terá de colher ovos em desenvolvimento fora da cavidade do corpo, que pode ser mais facilmente feito usando um par de pinças anguladas ou pinça. </li><li> Use agulhas dissecção ao pino abrir as paredes do corpo a uma bandeja de dissecação, e ângulo os pinos para que o rim pode ser visualizado. O rim irá possuir uma forma característica (tronco, cabeça / cauda sela) e cor, sendo intercaladas com pigmentação em tons preto (Figura 2). Você também pode ver a aorta cheio de sangue periférico, que passa pela linha média da estrutura do órgão. </li><li> Use uma pinça fina para separar o rim da parede dorsal do corpo, usando um par de fórceps para tirar o rim como você separa o órgão a partir do tecido conjuntivo que a fundamentam. </li><li> Delicadamente, coloque o rim para o veículo desejado para posterior estudo de células vivas, tais como um tubo de microcentrífuga contendo PBS 1x para a preparação FACS. </li></ol> 2. Preparação e dissecção do rim zebrafish adultos a partir de uma amostra de animais fixos <ol><li> Prepare uma solução de 4% PBST paraformaldehyde/1X. Ferva a solução para dissolver o PFA em solução, então resfriar a mistura para 4 ° C e adicionar dimetilsulfóxido 0,1%. Tivemos o maior sucesso com a preservação do tecido do uso de soluções acabadas de fazer PFA em oposição a alíquotas congeladas. Faça solução suficiente para submergir o peixe-zebra adulto durante a dissecção. </li><li> Encha uma bandeja de dissecação com solução de fixação suficiente para submergir o peixe-zebra adulto durante a dissecção. Nós execute as etapas subseqüentes com esta bandeja posicionada sob o microscópio, o que pode ser colocado em um capuz químico para minimizar a exposição ao odores fixação. </li><li> Selecione um peixe-zebra adulto entre 3-6 meses de idade para dissecção. </li><li> Euthanize o peixe, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por cerca de cinco minutos, observando com cuidado para ver que as brânquias e coração parar de bater. </li><li> Usando uma colher, retire o peixe do banho tricaina em uma pequena quantidade de solução, decantar a solução e gentilmente colocar o animal em uma toalha de papel. </li><li> Use uma tesoura afiada dissecção para remover a cabeça do animal, fazendo um corte logo atrás do opérculo branquial (Figura 1, Um caminho). Descartar a cabeça em um recipiente de resíduos de risco biológico, e imediatamente colocar o animal na bandeja de dissecação PFA contendo. </li><li> Use a tesoura de dissecção para abrir o corpo do animal, fazendo uma longa incisão ventral, a partir da cabeça e terminando na cauda, ​​na base da nadadeira caudal (Figura 1, B caminho), e manter o corpo parcialmente submerso durante o procedimento. </li><li> Remover os órgãos internos do animal usando um par de pinças de dissecção / forceps, e colocá-los no lixo de risco biológico. Tenha cuidado para não escovar a parede do corpo dorsal, pois este é o local do rim (Figura 2). </li><li> Use agulhas dissecção ao pino abrir as paredes do corpo, e os pinos ângulo de modo que o rim pode ser visualizado. O rim irá possuir uma forma característica (cabeça, sela, cauda) e cor, sendo intercaladas com pigmentação em tons preto (Figura 2). Você também pode ver a aorta cheio de sangue periférico, que passa pela linha média da estrutura do órgão. </li><li> Fixar a amostra durante a noite, colocando a bandeja a 4 ° C, quando você é feito com amostras de organizar o desejado. </li><li> No dia seguinte, retire a solução PFA da bandeja e substituir com 1x PBST. </li><li> Use uma pinça fina para retirar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo, usando um par de fórceps para tirar o rim como você separa o órgão a partir do tecido conjuntivo que a fundamentam. O tecido renal será macio e flexível do DMSO na solução fixadora, tornando possível para dissecar o órgão rim inteiro em uma única peça. </li><li> Use um amplofuro pipeta de transferência para colocar o rim em um tubo de microcentrífuga. </li><li> O rim pode agora ser processada posteriormente para realizar montagem histológica ou toda em estudos de expressão gênica situ com base no estudo desejado. </li></ol> 3. Resultados representativos: Os passos que estão diagramadas na Figura 1 indicam o procedimento de dissecção. O rim pode ser identificada com base na sua forma característica e coloração, e localização anatômica na parede dorsal da cavidade corporal do animal, como mostrado na Figura 2. Após a dissecção de um rim montagem amostra fixa, toda a hibridização in situ pode ser usado para localizar a expressão de um gene de interesse, como mostrado na Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Procedimento que permite o acesso direto para dissecar o rim adulto zebrafish. (A) zebrafish Euthanized é dissecado de forma gradual (indicados por números e setas) para dar ao pesquisador o acesso mais fácil ao órgão renal completa. Imagens da cavidade abdominal antes (B) e depois (C) a remoção dos órgãos abdominais. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:. Visualização do rim zebrafish em uma amostra unfixed Após a remoção de órgãos na cavidade do corpo, o rim aparece como um órgão único e achatado que é aderente à parede do corpo dorsal através de tecidos conjuntivos (A), e foi esquematizada (B) para mostrar a sua forma anatômica. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: mount inteiro em hibridizações in situ realizadas em todo o órgão adulto rim. (A) cadherin17 transcrições são detectados no túbulo de néfrons renais de adultos, ampliada em (A &#39;). (B) transcrições mafba estão localizadas tipos néfron proximal de células no rim adulto (compare a túbulo inteira no painel A). (B&#39; ) Uma visão ampliada de expressão mafba revela que as transcrições são especificamente localizada no podócitos (P), as células do sangue filtro (glomérulo) e túbulo contornado proximal (PCT).

<ol>
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I., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+expands+the+renal+progenitor+cell+population.">Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Células-tronco adultas são componentes dinâmicos e essenciais que mantêm a forma corporal do adulto 1. Células-tronco adultas também pode servir para neutralizar os danos que a incorre corpo durante estados de doença e da disfunção ou perda de células-tronco adultas podem levar ao declínio da função do órgão e tem sido implicado a conduzir neoplasias malignas do câncer e contribuem para o envelhecimento. Células-tronco adultas apresentam propriedades celulares que os distinguem dos tipos de células diferenciadas. Após a divisão celular, as células-tronco adultas são capazes de auto-renovação ea produção de células progenitoras que, por sua vez pode dar origem a descendentes diferenciados distintas. Há um grande interesse em compreender os caminhos que regulam as decisões célula destino e potência de células-tronco adultas devido ao seu papel importante na homeostase do tecido 1. Por exemplo, cientistas, atualmente, muitos procuram identificar os sinais que mantêm várias populações de células-tronco adultas em seu nicho, ou microambiente especializado, e como este nicho é afetado por fatores humorais. Adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) são células pluripotentes que o combustível o rejuvenescimento contínuo de células sangüíneas em animais 8. Hematopoese é um processo vibrante que está constantemente em curso durante a vida de um organismo vertebrado porque o maduro tipos de células diferenciadas do sangue são de curta duração e, portanto, devem ser repostos regularmente. Como eles se dividem, HSCs suprir esta demanda crucial de auto-renovar e produzir uma série de progenitores que dão origem ao eritróide, megacariócitos linhagens, linfóide e mielóide. Cada um destes tipos de células do sangue executa funções originais na circulação, incluindo o fornecimento de troca gasosa para o tecido, uma forma de selar ferimentos aos vasos sanguíneos através da formação de coágulos, ou mecanismos de defesa contra patógenos invasores. Enquanto HSCs foram reconhecidos por muitos anos, uma infinidade de questões fascinantes permanecem sem resposta sobre essas células incrível. Estudos recentes identificaram subclasses de HSCs com diferentes longo prazo auto-renovação propriedades, e da elucidação dos componentes do nicho e sinais que modulam o comportamento HSC 8. O peixe-zebra é agora entre os pilares da hematopoiese paradigmas de investigação, com base nos atributos genéticos e moleculares deste modelo animal 8. Pesquisa utilizando o zebrafish levou a novas percepções sobre a biologia HSC que são conservados com os vertebrados superiores, como mamíferos, enfatizando a importância de investigações biomédicas peixes de sangue 8. Historicamente, o conhecimento sobre HSCs abriu o caminho para as expedições que procuram descobrir se outros órgãos do corpo são mantidos por células-tronco adultas. Numerosas populações de células-tronco adultas são agora apreciada a existir, variando através de diversas estruturas do cérebro para o intestino, pele e músculo esquelético. Esforços contínuos na área de células-tronco procurar identificar como as células-tronco adultas e até mesmo outros tipos de células diferenciadas pode exibir a potência reforçada em várias configurações. Com relação ao rim, tem havido grande debate entre os nefrologistas para saber se existem células-tronco renal 16. Descobertas independentes têm documentado populações de células renais de mamíferos que possuem diferentes graus de potencial regenerativo, mas um entendimento coeso desses relatórios ainda não foi alcançado. Curiosamente, há fortes evidências para apoiar a noção de que muitas espécies de peixes possuem células que podem robustamente combustível regeneração dos néfrons danificadas, bem como crescer néfrons inteiramente novo na fase adulta 9. Recente trabalho identificou as características moleculares das células-tronco adultas renal no zebrafish 10,11, e demonstrou a potência auto-renovação desses chamados renal tronco / progenitoras (RPCs) 11. Futuros estudos são necessários para verificar se células do rim análogas estão presentes nos mamíferos. No entanto, as investigações continuaram sobre os mecanismos celulares e moleculares que regulam RPCs peixes pode fornecer insights sobre como proezas regenerativa pode ser estimulada no rim de mamíferos. É evidente que ainda há muito a ser entendido sobre RPCs, e que muitas ferramentas agora disponíveis para o pesquisador zebrafish podem ser implementadas para enfrentar essas questões intrigantes. Neste protocolo, descrevemos o nosso método para a identificação e dissecção anatômica do rim zebrafish adulto. Medidas alternativas podem ser usadas para dissecar o rim, tais como a abertura da cavidade abdominal ventral com uma incisão com uma tesoura de dissecção, no entanto, encontramos o maior sucesso no acesso a todo o rim quando a parede abdominal está preso aberta ea cabeça é removida. Sangue e rins pesquisadores tanto que desejam isolar e trabalhar com esses tipos de células pode usar o método de dissecação. Note-se que o método que descrevemos para isolar e working com o rim adulto zebrafish certamente não é limitada a cientistas que desejam seguir perguntas da biologia de células-tronco adultas, como a dissecção deste órgão pode facilitar os estudos para os pesquisadores de uma investigação sobre temas que vão desde a fisiologia do envelhecimento. Além disso, este método pode ser combinada com outras tecnologias, como os transgênicos, de modo a molecularmente rótulo e, em seguida, purificar e estudar subpopulações discretas de sangue ou de células de rim tipo selvagem ou mutante geneticamente zebrafish 11. Olhando para a frente, como procedimentos de purificação detalhada dos tipos de células-tronco e progenitoras é vital para ganhar o conhecimento sobre como seu comportamento é regulado, como testes operacionais, tais como transplante ou cultura progenitor constituem a base pela qual a potência e identidade dessas células é definido. Recentes avanços em métodos de cultura de células progenitoras hematopoéticas abrir muitas novas avenidas para o estudo, e pode ser adaptado a cultura das populações renal 17. Genética zebrafish químicos têm sido bem sucedidos na identificação de vias que modulam HSCs e progenitores renal em vários contextos 18-20, e continuará a ser uma avenida útil para testar em combinação com as técnicas de biologia celular acima. Tomados em conjunto, tem havido uma série de contribuições inovadoras para os campos de hematologia e nefrologia utilizando o modelo peixe-zebra, e continuou a pesquisa nessas arenas promessas de exercer maior entendimento de transformação nos próximos anos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Pinça de dissecção </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Pinça de dissecção ângulo </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Microscopia eletrônica de Serviços </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

Investigadores que trabalham no campo emergente da biologia de células estaminais adultas procuram entender os sinais que regulam o comportamento ea função das células tronco durante a homeostase normal e estados de doença. A compreensão das células-tronco adultas tem amplas implicações para o futuro chegar de uma medicina regenerativa. Por exemplo, um melhor conhecimento sobre a biologia das células estaminais adultas podem facilitar o desenho de estratégias terapêuticas em que órgãos são acionados para se curar ou mesmo a criação de métodos para órgãos de crescimento in vitro que podem ser transplantados para seres humanos 1. O peixe-zebra tornou-se um modelo animal poderosa para o estudo da biologia celular vertebrados 2. Houve uma extensa documentação e análise do desenvolvimento embrionário no zebrafish 3. Só recentemente os cientistas procuraram documento anatomia adultos e técnicas de dissecção cirúrgica 4, como tem havido um movimento progressista dentro da comunidade zebrafish para ampliar as aplicações deste organismo de pesquisa para estudos com adultos. Por exemplo, há expansão dos interesses no uso de zebrafish para investigar a biologia de populações de células-tronco adultas e fazer modelos adultos sofisticados de doenças como o câncer 5. Historicamente, o isolamento do rim adulto zebrafish tem sido fundamental para o estudo da hematopoiese, como o rim é a localização anatômica da produção de células sanguíneas em peixes 6,7. O rim é composto de unidades de néfrons funcionais encontradas em arranjos arborizada, cercada por tecido hematopoiético que está disperso por todos os espaços de intervenção. O componente hematopoiético é constituído por células-tronco hematopoéticas (HSCs) e seus descendentes que habitam o rim até que diferenciar terminal 8. Além disso, sabe-se agora que um grupo de renal tronco / progenitoras (RPCs) também habitam o órgão rim paulistinha e permitir que tanto a regeneração do rim e do crescimento, como observado em outras espécies de peixes 9-11. À luz desta nova descoberta, o rim zebrafish é um órgão que abriga a localização de duas oportunidades para tronco adultas estudos de biologia celular. É claro que muitas questões pendentes poderiam ser bem servida com este sistema experimental. Para incentivar a expansão desse campo, é benéfico para documentar métodos detalhados de visualizar e, em seguida, isolar o órgão rim adulto zebrafish. Este protocolo detalhes nosso procedimento para dissecção do rim adultos de ambos os animais unfixed e fixos. Dissecção do órgão renal pode ser usada para isolar e caracterizar células-tronco hematopoéticas e renal e seus filhos usando técnicas estabelecidas, como a histologia, separação de células ativadas por fluorescência (FACS) 11,12, 13,14 perfil de expressão, e transplante 11,15. Esperamos que a divulgação deste protocolo irá proporcionar aos pesquisadores com o conhecimento para implementar uma utilização mais ampla de estudos zebrafish que finalmente pode ser traduzido para aplicação humana.

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

O rim zebrafish é o lar de ambos renal e hematopoiéticas tronco adultas / progenitoras das células, e representa uma excelente oportunidade para estudar essas células tipos e seus descendentes em um organismo modelo vertebrados. Aqui, nós demonstramos um procedimento de dissecação detalhada que permite ao pesquisador identificar e remover cirurgicamente o rim zebrafish adulto, que pode ser usado para aplicações como isolamento de células, transplantes, e estudos de expressão de rim e / ou populações de células do sangue.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K visualizações.  University of Notre Dame. O rim zebrafish é o lar de ambos renal e hematopoiéticas tronco adultas / progenitoras das células, e representa uma excelente oportunidade para estudar essas células tipos e seus descendentes em um organismo modelo vertebrados. Aqui, nós demonstramos um procedimento de dissecação detalhada que permite ao pesquisador identificar e remover cirurgicamente o rim zebrafish adulto, que pode ser usado para aplicações como isolamento de células, transplantes, e estudos...

Vídeo: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...