Este trabalho é apoiado por Howard Hughes Medical Institute e uma concessão do NIH para o estudo da hematopoiese embrionária.

Parte 1. Preparação de material de injecção <ol><li> Tg (globina: GFP) células: </li><li> Sangrar peixes doadores adultos usando ponteira 10ul revestido em heparina (1unit/ul) para pescar punção por trás de emalhar. </li><li> Aspirar glóbulos vermelhos e dispensar em tampão celular (0.9x PBS + 5% de SFB + 1% Pen / Strep). </li><li> Suspensão de células filtro sobre malha 40uM e determinar a concentração de células usando hemocitômetro como descrito por LeBlanc et al. </li><li> Spin down e ressuspender em tampão celular na concentração desejada de tal forma que o volume de injeção final não é mais do que 5ul. Aqui nós injetar 1,5-2000000 células / destinatário. </li><li> Para o, dextran Texas Red ®, dissolver o corante em DPBS para uma concentração final de injecção de 10-12 mg / mL. Plano para injetar 4 uL por peixe. </li></ol> Parte 2. Injeção <ol><li> Anestesiar peixes em tricaina (4.2ml (4mg/ml) peixes de água tricaine/100ml). </li><li> Lavar seringa Hamilton 3-4 vezes antes da injeção utilizando etanol 70%. Enxágüe 3-4 vezes com DPBS 0.9x. </li><li> Coloque os peixes lado dorsal para cima e virado para a direita na esponja úmida. </li><li> Segure a seringa Hamilton com a mão direita e com o dedo indicador sobre o êmbolo. Suavemente estabilizar o corpo do peixe com a mão esquerda. </li><li> Posição da agulha com o bisel voltado para cima de tal forma que se o olho do peixe s fosse um relógio, a agulha seria apontar para a posição 7:00 e em um ângulo de 45 graus para o peixe (figura 1). </li><li> Inserir a agulha delicadamente 1-2 mm em posição 7:00 e lentamente o êmbolo. </li><li> Permitir que os peixes na água para recuperar E3 fresco. </li><li> Lavar agulha, como descrito acima, entre as injeções de reagentes diferentes. </li><li> Solução Flick célula para ressuspender as células a cada poucos minutos para evitar aglomeração de células. </li><li> Manter o fluxo de peixe por 1 semana com mudanças de água diariamente para evitar a infecção. Mantemos peixe na água UTI para esse período (10 ml + casaco Estresse pemafix 5mL + melafix 5mL por 38 litros de água E3). </li></ol> Parte 3. Resultados representante Quando realizada corretamente, é possível visualizar material injetado, se tiver sido rotulado de alguma forma. Por exemplo, Tg (globina: GFP), as células vermelhas do sangue deve ser visto sob um microscópio fluorescente dissecção circulando na vasculatura do destinatário peixes casper logo após a injeção, como mostrado na figura 2. Da mesma forma, a injeção de um dextran 70kDa, conjugado com Texas Red ® pode ser visualizado na vasculatura de peixe transparente imediatamente após a injeção de retro-orbital (figura 3). Células de rim fluorescente de Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores também podem ser injetados retro-orbital em peixes irradiados casper destinatário. Estas células acabará casa até a medula destinatário (figura 4a) e pode então ir para repovoar o rim depois de várias semanas (figura 4b). Se a injecção é muito raso ou o ângulo da agulha ignora a retro-orbital cavidade do seio venoso, material injetado pode ser visualizado pooling em torno do olho ou saindo dela. Alternativamente, se a injeção é muito profundas, os peixes podem sofrer danos tecido ou sangramento excessivo, mas eles ainda podem se recuperar. Quando realizada corretamente, a mortalidade após retro-orbital injecção deve ser inferior a 5% do peixe total injetado e sucesso de entrega para a corrente sanguínea deve ser superior a 90% do peixe total injetado. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: Ilustração de retro-orbital técnica de injeção. O olho direito do peixe é representado como um relógio analógico em que os sete posição do relógio o corresponde ao local de injeção correta. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2: Tg (globina: GFP) glóbulos vermelhos circulantes na vasculatura da cauda de um peixe adulto casper três dias depois de retro-orbital injeção. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3: A injeção de sucesso de um dextran 70kDa conjugado com Texas Red ® usado como corante fluorescente produz vasculatura no peixe adulto transparente, casper e é facilmente visualizado utilizando microscopia de fluorescência padrão todo animal. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="figura 4a" /> Figura 4a: Três dias após retro-orbital injeção de células de rim de todo medula Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, as células podem ser visualizados homing para a medula renal de peixes irradiados receptor adulto casper. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Figura 4B" /> Figura4b: Quatro semanas após a retro-orbital injeção de células de rim de toda a medula da Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, o repovoamento do rim destinatário com células da medula do doador verde toda rim pode ser visualizado na irradiados peixes receptor adulto casper.

<ol>
	<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model.">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li><li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route.">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li><li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish.">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li></ol>

Retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto dá a maior eficiência de entrega de material injetado na corrente sanguínea com a menor incidência de mortalidade. Devido à natureza do local de injeção, a punção parece curar rapidamente, diminuindo a ocorrência de infecção e da quantidade de perda de sangue. O site pode até ser injetado repetidamente durante um curto período de tempo para injeções diárias de medicamentos, por exemplo. Grandes quantidades de droga deve ser compr...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>2106</td>
<td>Preweighed vial of 300 USP units</td>
</tr>
<tr>
<td>Tricaine-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Western Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MS-222</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran, Texas Red&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes Inc.</td>
<td>D1830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5mM NaCl 
0.17 mM Kcl 
0.33 mM CaCl2 
0.33 mM MgSO2
</td>
</tr>
<tr>
<td>Microliter Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80300</td>
<td>701N 10uL SYR (26s/2&#x201D;/2)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

retro-orbital injection in adult zebrafish

Tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema modelo para farmacológicos e químicos estudos genéticos. Injecção intravenosa (IV) é muitas vezes a forma mais eficaz e não invasivo de transporte de um agente de interesse. No peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), IV injeção de drogas tem sido um desafio, porque o diâmetro dos pequenos vasos. Esta também se mostrou um obstáculo significativo para a injeção de células durante o transplante de células-tronco hematopoética. Historicamente, as injeções para a corrente sanguínea foram feitas diretamente através do coração. No entanto, este procedimento intra-cardíaca tem uma taxa de mortalidade muito elevada como o coração é freqüentemente furado durante a injeção de deixar o peixe propensos à infecção perda de sangue, maciça ou lesão de órgão fatal. Com base na nossa experiência com o mouse, temos desenvolvido um procedimento de injeção novo no zebrafish em que o local da injeção é atrás do olho e no seio venoso retro-orbital. Este retro-orbital técnica de injeção (RO) tem sido empregada com sucesso em ambos injeção de drogas nos peixes adultos, bem como o transplante de células da medula todo rim. Injeção RO tem uma taxa de mortalidade muito menor do que a injeção intra-cardíaca tradicional. Peixes que são injetados retro-orbital tendem a sangrar a injeção menos seguinte e estão em um risco muito menor de lesão de um órgão importante como o coração. Células Além disso, quando realizado adequadamente, injetado e / ou drogas entrar rapidamente na corrente sangüínea permitindo compostos para exercer seu efeito sobre o peixe inteiro e células de rim facilmente o lar de seu nicho. Assim, esta técnica minimiza nova injeção de mortalidade, permitindo a entrega eficiente de material para a corrente sanguínea de peixes adultos. Aqui nós exemplificar essa técnica, retro-orbital injeção de Tg (<em&gt; Globina</em&gt;: GFP) em células adultas<em&gt; Casper</em&gt; Peixes, bem como a injeção de um corante fluorescente vermelho (dextran, Texas Red<em&gt;</em&gt;) Em adultos<em&gt; Casper</emPeixe&gt;. Em seguida, visualize injeções de sucesso por microscopia de fluorescência toda animais.

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Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

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