Este trabalho foi financiado por uma doação do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) dentro do foco Bernstein: base neuronal da Aprendizagem (BFNL) para DE Agradecemos Randolf Menzel de valiosos comentários sobre uma versão anterior do manuscrito.

1. Abelhas captura da Hive <ol><li> Um dia antes do experimento começa, entre 2 e 4 horas, deixando as abelhas da colméia são capturados. Para isso, uma pirâmide de luz UV plexiglass-permeável (altura = 30 cm, ápice de 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), o que é que pode ser fechado no ápice e na base, é realizada em um 20 - 30 cm de distância na frente da entrada colmeia com a base aberta e fechada para o ápice que as abelhas saindo da colméia entrar na base da pirâmide. A base é fechada e as abelhas capturados são levados para o laboratório para manuseio. </li></ol> 2. Transferência Bees da pirâmide em frascos de vidro <ol><li> No laboratório, a pirâmide é colocado sobre sua base. As paredes da pirâmide estão escurecidos (por exemplo, com uma toalha), mas o ápice fica descoberto. Por causa de sua fototaxia positiva, as abelhas deixarão a pirâmide por meio do ápice quando aberto. Uma por uma, as abelhas são transferidas da pirâmide em frascos de vidro, mantendo os frascos sobre o ápice aberto. Um frasco é usado por abelha. Portanto, o ápice é fechado quando uma abelha entra no frasco. </li></ol> 3. Abelhas mobilização Tubes <ol><li> As abelhas são imobilizadas por refrigeração-los na frascos de vidro em gelo por 2,5-3,5 min. Aconselha-se a assistir a abelha e removê-lo do gelo, assim que pára de se mover. </li><li> A única abelha imobilizado é aproveitada em um pequeno tubo de plástico com fita adesiva, de modo que é capaz de se mover livremente sua tromba, mas não a sua cabeça, tórax e pernas. É importante que o pescoço não é comprimido. </li><li> Cada abelha fixo em um tubo de plástico é colocado em um furo numeradas em um rack para melhor manuseio e identificação. Depois de ter sido removido para a recuperação de condicionamento ou de memória do tubo é sempre retornado ao poço exatamente o mesmo. </li></ol> 4. Abelhas alimentação <ol><li> Na primeira noite (06/04 horas), depois de ser pego, as abelhas são alimentadas até a saciedade com solução de sacarose (0,88 M, o açúcar branco refinado doméstico dissolvido em água da torneira). Para alimentar uma abelha, seu PER é eliciada tocando suas antenas com a solução de sacarose e que o animal é permitido consumir uma gota (4 mL) da solução de sacarose. As abelhas são alimentadas uma após a outra repetidamente até que eles já não apresentam um PER rápido e confiável quando suas antenas são tocados com solução de sacarose. </li><li> Em cada noite subseqüente (4-6 pm) das abelhas são alimentadas experimento uma após a outra quatro vezes com uma gota de solução de sacarose (4 mL, 0,88 M, açúcar branco refinado resolvido em água da torneira). É importante que a solução de sacarose não é espalhado em antenas da abelha ou da tromba durante a alimentação e que os tubos não estão contaminados com solução de sacarose. As abelhas não devem ser alimentados em ou perto do local condicionado para excluir a possibilidade de associar o contexto de formação com o estímulo de sacarose. </li></ol> 5. Mantendo abelhas Harnessed Overnight <ol><li> Abelhas são mantidas durante a noite em uma bacia de plástico em temperatura ambiente. Água da torneira é cheia na bacia (cerca de 0,5-1 cm de altura). Racks com as abelhas são colocadas aproveitado na bacia acima da linha d&#39;água usando placas de ELISA como uma plataforma. Finalmente, a bacia é coberta com papelão. </li></ol> 6. Condicionado olfativa Na primeira manhã (10:00) do experimento de condicionamento olfativo é realizada. O estímulo condicionado (CS) é um odor, o estímulo não condicionado (EUA) é solução de sacarose. <ol><li> 4 mL do odor (óleo de cravo, por exemplo) são pipetados em um papel filtro rodada (1,3 cm de diâmetro) que é então inserido em uma seringa de 20 mL. O odor é pipetado sob um capuz e dicas de filtro são usados ​​para evitar a contaminação da pipeta. </li><li> O rack com abelhas aproveitado é colocado próximo ao local 30 min condicionado antes do procedimento de condicionamento começa, mas a uma distância para o lugar na frente de um tubo de escape onde as abelhas só são condicionadas. </li><li> Condicionamento consiste em três pares de odor (o estímulo condicionado, CS) e solução de sacarose (o estímulo incondicionado, EUA, 1,25 M) com um intervalo inter-ensaio (ITI), de 10 min. Um sinal acústico entregue ao pesquisador através de um leitor de áudio garante a data precisa de início do estímulo, estímulo offset, duração do estímulo e colocando. Um ensaio de aquisição começa com uma colocação de 10 segundos do animal na frente de um escape. Pouco antes do final do sec 10 a seringa contendo o odor é colocado 3 centímetros na frente da abelha orientadas para antenas da abelha. Posteriormente, o odor é apresentado durante 5 segundos, empurrando 20 mL de ar através da seringa. Após os primeiros 3 segundos do flagelos distal de ambas as antenas são tocados com uma solução de sacarose-umedecidos palito e animais estão autorizados a lamber o palito moistend por 4 seg. 13 seg após o término da estimulação CS, as abelhas são tomadas fora do contexto de formação e colocado de volta na prateleira. No total, um ensaio de treinamento dura 28 seg. É importante que nem antenas da abelha nem a tromba são cobertos com sacarose, após condicionamento. Por isso, tem que ser assegurado que o palito é apenas umedecido com solução de sacarose e que nenhuma gota de forma sacarose solução no palito. </li><li> Após o condicionamento dos racks são colocados de volta na tigela. </li><li> Comportamento dos animais durante o experimento, ou seja, a ocorrência do PER durante a colocação e CS e apresentação dos EUA, é monitorado e anotadas pelo experimentador. </li></ol> 7. Retenção de memória <ol><li> Testes de retenção pode ser realizada em qualquer intervalo de tempo (min até dias). O rack com abelhas é colocado perto do local condicionado min 30 antes do teste de memória começa. </li><li> Um teste de memória consiste em 5 segundos sem apresentação CS apresentação EUA. O teste começa com uma colocação de 10 segundos do animal na frente dos gases de escape. Posteriormente, o odor é apresentado durante 5 segundos, como descrito acima. O comportamento do animal, ou seja, a ocorrência do PER durante a colocação ea apresentação CS é anotado durante o experimento. </li><li> No final do experimento a resposta extention proboscis é novamente provocado tocando as antenas com solução de sacarose para garantir que o animal ainda é capaz de estender a sua tromba. </li></ol> 8. Injeção sistêmica O ponto de tempo de injeção sistêmica depende do delineamento experimental. <ol><li> Um pequeno buraco é feito na cutícula da parte posterior da rótula próxima à fissura scutal acima dos 17 músculos de vôo usando uma agulha hipodérmica descartável (21 G). </li><li> Usando um tubo de vidro capilar, uma solução mL é injetado através do buraco na cutícula no músculo de vôo. Experimentadores treinados são capazes de injetar uma abelha cada 30 segundos, permitindo um calendário preciso de injeção e condicionamento. </li></ol> 9. Abelhas alimentação durante o Experimento <ol><li> Na noite (4-6 pm), após condicionamento, as abelhas são alimentadas uma após a outra quatro vezes com uma gota de solução de sacarose (4 mL, 0,88 M, o açúcar refinado branco dissolvido em água da torneira). É importante que a solução de sacarose não é espalhado em antenas da abelha ou da tromba durante a alimentação e que os tubos não estão contaminados com solução de sacarose. As abelhas não devem ser alimentados em ou perto do local condicionado para excluir a possibilidade de associar o contexto de formação com o estímulo de sacarose. </li></ol> 10. Coleta de Dados e Análise de Dados <ol><li> Ocorrência da resposta de extensão tromba durante o experimento é monitorado. A abelha é marcado positivo se estende a sua tromba entre o início do CS ea apresentação de os EUA (durante o treinamento) ou durante a apresentação CS (durante a fase de teste), cruzando uma linha virtual entre as mandíbulas abertas. </li><li> Para ser incluído na análise de animais deve cumprir dois critérios: devem sobreviver todo o experimento e eles devem mostrar a resposta de extensão incondicionada probóscide (PER) para solução de sacarose no final do experimento. A porcentagem de abelhas mostrando o PER durante a aquisição e testes de retenção é plotado para cada apresentação CS. </li></ol> 11. Resultados representativos: Dois experimentos são apresentados aqui. No primeiro experimento olhamos para o impacto da injeção sistêmica de tampão fosfato (PBS, em mM: NaCl 137, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) na aprendizagem e no longo prazo a formação da memória. Três grupos de abelhas foram treinados com três CS-US pares, com um intervalo inter-teste de 10 min: um grupo não-tratado, um grupo que foi injetado com 1 mL PBS 30 min antes do treino, e um grupo sham-injetado tratados da mesma forma que o grupo PBS-injetada, mas sem injetar PBS. 24 h após a formação da memória foi testada com uma apresentação CS em todos os três grupos. A percentagem de animais que apresentem a resposta condicionada durante o condicionamento aumenta significativamente ao longo dos três ensaios de formação (Fig.1, ANOVA para medidas repetidas para o fator tempo F 2378 = 340,456, p &lt;0,05). Nenhuma diferença no PER pode ser observada entre os três grupos durante o condicionamento (ANOVA para medidas repetidas para o fator de grupos F2, 189 = 1,299, p&gt; 0,05). Isso vale para um teste de retenção de 24 h (F2, 187 = 0,752, p&gt; 0,05) na comparação entre animais não tratados com PBS-injetado animais e sham-injetado. No segundo experimento, demonstramos a inibição da retenção da memória de três e quatro dias depois do treinamento quando o inibidor da síntese protéica anisomicina (10 mM) foi injetado sistemicamente 30 min depois de três CS-US emparelhamentos. Comparação de um grupo anisomicina-injetados com um grupo PBS-injetado revela uma diferença significativa entre os grupos durante a retenção de test (Fig.2, ANOVA para medidas repetidas para o fator grupo F1, 94 = 8,86, p &lt;0,05). A grande diferença pode ser observada no teste de memória no dia 3 e dia 4. Isto assemelha-se os resultados de Wüstenberg et al. 18 anos, que também condicionada abelhas com três CS-US emparelhamentos, embora com um protocolo diferente. <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Lesão cutícula ou injeção de PBS não altera aquisição e retenção da memória. Animais foram treinados com três CS-US pares (aquisição). Após 24 h, a memória foi testada (Retenção da Memória). Trinta minutos antes do treino, um buraco foi feito na cutícula dos dois grupos (lesão, PBS) e um desses grupos foram injetados com 1 mL de PBS (PBS). Um terceiro grupo foi deixada intacta (sem tratamento). Apresentada é a percentagem de animais para cada grupo responder a apresentação com um odor PER. Uma ANOVA não revelou diferenças significativas entre os grupos na fase de aquisição (F2, 189 = 1,299, p&gt; 0,05) ou na retenção da memória (F2, 187 = 0,752, p&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Injeção de anisomicina 40 min após o emparelhamento CS-US última reduz a retenção de memória de três dias e quatro dias depois do treinamento. Animais foram treinados com três CS-US pares (aquisição) e injetados com 1 mL 10 mM anisomicina (Aniso) ou 1 mL de PBS 1 h após o julgamento primeira formação. Memória foi testada (Retenção da Memória) 24 h, 48 h, 72 he 96 h depois. Apresentada é a porcentagem de animais por grupo respondendo a apresentação com um odor PER. A injeção de anisomicina leva a uma redução significativa de memória de retenção de 72 h e 96 h após o treinamento (F1, 94 = 8,86, p &lt;0,05), como revelado por uma ANOVA.

<ol>
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Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).</li><li>Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+recovery+from+extinction+depends+on+the+reconsolidation+of+the+acquisition+memory+in+an+appetitive+learning+paradigm+in+the+honeybee+(Apis+mellifera.">Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera.</a> J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).</li><li>Stollhoff, N., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consolidation+of+an+extinction+memory+depends+on+the+unconditioned+stimulus+magnitude+previously+experienced+during+training.">Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training.</a> J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).</li><li>Snodgrass, R. 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Physiol. 79, 33-69 (1975).</li><li>Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+learning+and+the+individual+evaluation+of+the+reward+in+honey+bees+(Apis+mellifera+L.).">Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).</li><li>Sanchez, B. r. i. t. o., G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+studies+on+tarsal+gustation+in+honeybees:+sucrose+responsiveness+and+sucrose-mediated+olfactory+conditioning.">Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning.</a> J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. 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Não há conflitos de interesse declarados.

<ol><li> Captura das abelhas: Para coletar as abelhas obreiras experientes, as abelhas são capturados ou de manhã ou à tarde, evitando o tempo em que as abelhas jovens estão em vôos orientação 19. Forrageiras ou coletar pólen ou néctar. Diferenças entre o pólen e néctar forrageiras têm sido observadas de acordo com sua capacidade de resposta de açúcar e suas habilidades de aprendizagem 20. A fim de pegar forrageiras néctar apenas, uma fonte de alimento artificial preenchido com uma solução de sacarose pode ser instalado próximo à colméia e os animais podem ser recolhidos lá. Forrageiras pólen retornando à colméia pode ser identificado pelo cestas de pólen nas patas traseiras 20. </li><li> Fixação e manipulação: Extended refrigeração de abelhas no gelo deve ser evitado, pois pode afetar sua capacidade de aprender e sobreviver até o final do experimento. Tarsi tem que ser fixado cuidadosamente dentro do tubo para evitar a estimulação acidental com solução de sacarose. Isto é importante, porque as abelhas têm sido mostrados para aprender pela estimulação do tarso com succrose solução 3,21. </li><li> Condicionamento olfativo: O número de tentativas de condicionamento, o intervalo inter-julgamento, eo ponto de tempo de teste pode ser variado, dependendo do foco do estudo 3,22. </li><li> Alimentação: O nível de saciedade de abelhas é conhecido por afetar seu desempenho de aprendizagem e retenção de memória 3,23. Isso tem de ser tida em conta no planejamento de experimentos. </li><li> Injecção: sacos de ar estão localizados nos 17 tórax de abelhas. Estas partes vitais do sistema respiratório são necessários para a sobrevivência. Assim, cuidados devem ser tomados para não danificar os sacos de ar durante a injeção. A liberação de bolhas de ar indica danos ao sacos aéreos. </li></ol>

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Syringe Omnifix 20 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B.Braun, Melsungen, Germany </td>
<td>4616200 V</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>White refined household sugar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kaisers Supermarket, Berlin, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clove oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bombastus, Freital, Germany </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multipette plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
<td>4981 000.019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rack for 30 bee tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV light-permeable plexiglass pyramid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>height = 30cm, 
apex 3.5 x 3.5cm, 
base 18x18cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sticky tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tesa, Hamburg, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillator sticks 1-5&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Selzer, Driedorf-Roth, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillator tips 1-5&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Selzer, Driedorf-Roth, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter paper 0.16-0.2 mm thick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Macherey-Nagel, D&uuml;ren, Germany</td>
<td>MN 616 or MN615</td>
<td>Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable hypodermic needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B. Braun, Melsungen, Germany</td>
<td>4657683</td>
<td>0.45 mm diameter</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (apis mellifera)

Abelhas (Apis mellifera) são bem conhecidos por suas habilidades de comunicação e orientação e para os seus 1,2 impressionante capacidade de aprendizagem. Porque a sobrevivência de uma colônia de abelhas depende da exploração de fontes de alimentos, as abelhas forrageiras aprender e memorizar os sites flor variável, bem como a sua rentabilidade. Abelhas forrageiras podem ser facilmente treinados em ambientes naturais onde forragem em um local de alimentação e aprender os sinais relacionados, tais como odor ou cor. Aprendizagem associativa apetitivo também pode ser estudado sob condições controladas em laboratório pelo condicionamento da resposta de extensão probóscide (PER) de abelhas individualmente aproveitado 3,4. Este paradigma de aprendizagem permite o estudo dos mecanismos neuronais e moleculares subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e altamente confiável 5-12. Uma abordagem a farmacologia comportamental é usado para estudar os mecanismos moleculares. Medicamentos são injetados sistemicamente a interferir com a função de moléculas específicas durante ou depois da aprendizagem e formação da memória 13-16. Aqui demonstramos como treinar abelhas aproveitado no condicionamento PER e como aplicá-drogas sistemicamente por injecção no músculo de vôo de abelhas.

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

19.2K visualizações.  Freie Universität Berlin. Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.

Vídeo: Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Neurociência

Behavioral Determination of Stimulus Pair Discrimination of Auditory Acoustic and Electrical Stimuli Using a Classical Conditioning and Heart-rate Approach

Acute animal preparations have been used in research prospectively investigating electrode designs and stimulation techniques for integration into neural auditory prostheses, such as auditory brainstem implants1-3 and auditory midbrain implants4,5. While acute experiments can give initial insight to the effectiveness of the implant, testing the chronically implanted and awake animals provides the advantage of examining the psychophysical properties of the sensations induced using implanted devices6,7.
Several techniques such as reward-based operant conditioning6-8, conditioned avoidance9-11, or classical fear conditioning12 have been used to provide behavioral confirmation of detection of a relevant stimulus attribute. Selection of a technique involves balancing aspects including time efficiency (often poor in reward-based approaches), the ability to test a plurality of stimulus attributes simultaneously (limited in conditioned avoidance), and measure reliability of repeated stimuli (a potential constraint when physiological measures are employed).
Here, a classical fear conditioning behavioral method is presented which may be used to simultaneously test both detection of a stimulus, and discrimination between two stimuli. Heart-rate is used as a measure of fear response, which reduces or eliminates the requirement for time-consuming video coding for freeze behaviour or other such measures (although such measures could be included to provide convergent evidence). Animals were conditioned using these techniques in three 2-hour conditioning sessions, each providing 48 stimulus trials. Subsequent 48-trial testing sessions were then used to test for detection of each stimulus in presented pairs, and test discrimination between the member stimuli of each pair. 
This behavioral method is presented in the context of its utilisation in auditory prosthetic research. The implantation of electrocardiogram telemetry devices is shown. Subsequent implantation of brain electrodes into the Cochlear Nucleus, guided by the monitoring of neural responses to acoustic stimuli, and the fixation of the electrode into place for chronic use is likewise shown.

The application of a classical fear conditioning behavioral paradigm for auditory prosthetic research in rats is described. This paradigm provides a mechanism for identifying both detection of, and discrimination between, distinct acoustic and electrical stimuli using heart-rate as an outcome measure.

Determinação do Comportamento da Discriminação do estímulo acústico Par de estímulos auditivos e elétrica usando um condicionamento clássico e da freqüência cardíaca abordagem

Acute animal preparations have been used in research prospectively investigating electrode designs and stimulation techniques for integration into neural ...

The Mouse Forced Swim Test

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental manipulations that are aimed at rendering or preventing depressive-like states. Mice are placed in an inescapable transparent tank that is filled with water and their escape related mobility behavior is measured. The forced swim test is straightforward to conduct reliably and it requires minimal specialized equipment. Successful implementation of the forced swim test requires adherence to certain procedural details and minimization of unwarranted stress to the mice. In the protocol description and the accompanying video, we explain how to conduct the mouse version of this test with emphasis on potential pitfalls that may be detrimental to interpretation of results and how to avoid them. Additionally, we explain how the behaviors manifested in the test are assessed.

The forced swim test is validated as an experimental approach to assess potential antidepressant efficacy in rodents. Experimental animals are placed in a tank of water and escape-related mobility behavior is quantified. The common procedures for the mouse version of this test are described.

O Mouse Teste de Natação Forçada

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental ...

The Tail Suspension Test

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that are expected to affect depression related behaviors. Mice are suspended by their tails with tape, in such a position that it cannot escape or hold on to nearby surfaces. During this test, typically six minutes in duration, the resulting escape oriented behaviors are quantified. The tail-suspension test is a valuable tool in drug discovery for high-throughput screening of prospective antidepressant compounds. Here, we describe the details required for implementation of this test with additional emphasis on potential problems that may occur and how to avoid them. We also offer a solution to the tail climbing behavior, a common problem that renders this test useless in some mouse strains, such as the widely used C57BL/6. Specifically, we prevent tail climbing behaviors by passing mouse tails through a small plastic cylinder prior to suspension. Finally, we detail how to manually score the behaviors that are manifested in this test.

The tail-suspension test is validated as an experimental procedure to assess antidepressant efficacy of drug treatments in mice. Mice are suspended by their tails for six minutes and escape-related behaviors are assessed. We describe procedures used in conducting the tail suspension test.

O Teste de Suspensão da cauda

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...