Apoiada pela Universidade de Kentucky, Departamento de Biologia, Instituto de Estudos de Graduação e Faculdade de Artes e Ciências.

1. Introdução A visão mais recente abrangente do intestino posterior crustáceo foi cumprido em uma dissertação pelo Dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, EUA), que concentrou-se principalmente na modulação serotoninérgica e inervação (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustáceo foram primeiramente estudados mais de 100 anos atrás por Alexandrowicz, um pioneiro na anatomia comparativa (Alexandrowicz, 1909), que descreveu os vários aspectos da sua inervação. Pesquisa continuada ao longo dos anos, identificando os tipos de camadas musculares e arquitetura, abordando a função global do intestino grosso na osmorregulação para o animal inteiro, e examinando o controle moduladores da contratilidade hindgut por vários compostos (ver revisão por Musolf, 2007). É interessante notar que a parte anal do intestino posterior age não só para expulsar as fezes, mas também para levar até a água do ambiente para osmorregulação. Esta região do intestino pode sofrer frente ou para trás o peristaltismo, dependendo das necessidades do animal. Alexandrowicz (1909) identificou dois plexos nervosos que inervam o intestino posterior crustáceo, um plexo interno e um plexo externo, que mais tarde provou ser ricas fontes para a identificação e caracterização de neurotransmissores. Na década de 1950 Dr. Ernst Florey começou uma série de estudos farmacológicos no intestino posterior lagostas e demonstrou que as contrações são modulados pela acetilcolina e seus compostos relacionados e também pela adrenalina e noradrenalina (Florey, 1954). Florey, o descobridor de uma substância inibidora conhecido como &quot;fator-I&quot;, estudou os efeitos desta substância em várias preparações, incluindo o sistema GI em lagostas (Florey, 1961). Fator-I foi posteriormente demonstrado ser GABA. Assim, o intestino posterior lagostas desempenhou um papel importante nos estudos iniciais da inibição sináptica. Após a descoberta do GABA, outros transmissores putativa também foram mostrados para ser associados com os plexos e intestino posterior para provocar respostas fisiológicas. Tais transmissores incluem dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) dois peptídeos orcokinin (NFDEIDRSGFGFN e AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000). myosuppressin e um peptídeo (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide mais provável, cf Stemmler et al 2007). Cada uma destas substâncias modula hindgut contrações espontâneas, e todos, exceto GABA parece ser excitatório. O intestino grosso também responde a glutamato e quisqualato (Jones, 1962;. Errado et al 2003), mas as evidências claras para a inervação glutamatérgica não foi relatado. Mensageiros intracelulares que medeiam os efeitos dos diversos transmissores são em grande parte inexplorado, mas há evidências para o envolvimento de AMPc na capacidade da dopamina para aumentar as contrações (Knotz &amp; Mercier, 1995). Embora o intestino grosso crustáceos contratos espontaneamente após desnervação, tais contrações são tipicamente fraco e desorganizado (País de Gales, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Movimento peristáltico exige saída do motor coordenado do sistema nervoso central, aparentemente originários do gânglio última abdominal (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). Nos lagostins, a saída do motor é transportado para o intestino grosso através da raiz 7 ª abdominal, que contém 75 axônios cujos corpos celulares estão localizados no gânglio última abdominal (Kondoh &amp; Hisada, 1986). Pelo menos alguns dos peptídeos parecem ser fornecido ao plexo hindgut dos neurônios originários da última gânglio abdominal (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986), mas a dopamina é fornecido pelos neurônios em mais gânglios anterior (Mercier et al. 1991a). Desde a saída do motor através da raiz 7 ª abdominal é necessária para as grandes, as contrações coordenadas, é provável que alguns ou todos os transmissores listados acima suposto contribuir de alguma forma para o peristaltismo. Suas contribuições relativas, no entanto, não são conhecidos. Alguns insights podem ser obtidos através do estudo dos seus efeitos sobre os músculos circulares e longitudinais em separado (Mercier &amp; Lee, 2002). Além de controlar o movimento de alimento não digerido, o plexo nervoso associado com o crustáceo intestino posterior parece desempenhar um importante função endócrina associada muda. O intestino posterior do caranguejo, Carcinus maenas, contém células endócrinas que liberam hormônio hiperglicêmico crustáceo e sua peptídeo precursor relacionadas durante ecdise (Webster et al. 2000), sugerindo um papel importante na absorção de água e inchaço associado a muda. Assim, o intestino grosso crustáceos, participa em diversos processos fisiológicos importantes. Este relatório é basicamente uma ferramenta de ensino para o ensino médio avançado e alunos de graduação em cursos de fisiologia que participam na experimentação. O significado, bem como o potencial mecanismo por trás de como os contratos hindgut e funções podem ser abordados pelos alunos. Agentes farmacológicos, os neurotransmissores e neuro-hormônios serão usados, e curvas dose-resposta será construída, que irá envolver os alunos em como adquirir e interpretar os dados fisiológicos e farmacológicos. Um entendimento geral da função do receptor em relação aos agonistas e antagonistas também pode ser alcançado. Os alunos também aprenderão a apresentar os dados em forma gráfica para análise estatística. É muito fácil para dissecar e registrar as contrações do intestino posterior lagostim. Na preparação dissecado, o intestino é facilmente expostos a substâncias exógenas. A alteração na atividade peristáltica pode ser monitorada visualmente ou com um transdutor de força, o que também pode monitorar a força das contrações. Devido à sua simplicidade e confiabilidade como uma preparação bioensaio, o intestino posterior crustáceo ainda é muito útil para investigar questões muitas pesquisas sobre os mecanismos de peristaltismo, modulação de saída do motor e da contração muscular e função do receptor. O intestino grosso também é útil para testes de inseticidas, crustaceancides e poluentes para os mecanismos específicos de ações. 2. Métodos 2.1) Materiais <ul><li> lagostim </li><li> lagostas salina </li><li> instrumentos de dissecção (tesoura grossa e fina, grossa e uma pinça fina) </li><li> Sylgard de fundo placa de Petri </li><li> pinos de aço de dissecação </li><li> copos (para segurar soluções químicas) </li><li> parafilme (para cobrir a mistura e soluções) </li></ul> 2,2 Dissection) <ol><li> Lagostim (Procambarus clarkii), medindo 60-10 cm de comprimento do corpo deve ser colocado em gelo por 5 a 10 minutos para anestesiar o animal antes da dissecação começa. </li><li> Segure o lagostim anestesiados por trás as garras com uma mão. Rapidamente, corte da tomada de olho no meio da cabeça de ambos os lados, e depois decapitar o lagostim (Nota: o sangue da preparação será pegajoso quando seca, então lave as ferramentas quando concluída). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Decapitação de crustáceo </li><li> Cortar a chelipeds e pernas andar. </li><li> Cortar a tailfins esquerda e direita, deixando apenas o meio tailfin (uropod). </li><li> No lado dorsal do crustáceo corte ventralmente, tanto do lado esquerdo e direito da cutícula dorsal. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Remoção de Cutícula Dorsal </li><li> Cortadas transversalmente no lado dorsal da cutícula, certificando-se que o corte é superficial para evitar danos ao GI Em seguida, retire a parte inferior da cutícula dorsal abdominal. </li><li> Coloque o crustáceo dissecado em um prato Sylgard-alinhado. </li><li> Pin do crustáceo para o prato na ponta do tailfin. Pode-se usar mais pinos de cada lado do GI, conforme necessário para manter o corpo para baixo. </li><li> Encha o prato com solução salina lagostas cobrindo o GI Certifique-se continuamente para apagar o GI com solução salina usando uma pipeta. Salina é uma solução modificada de Van Harreveld (1936), que é feita com 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 13,5 mM CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES e ajustada para pH 7.4. O lagostim dissecados deve aparecer como mostrado na Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: lagostas dissecado com GI intacta. </li></ol> 2.3) Experimentos 2.3.1) As contrações no animal <ol><li> Ter soluções do composto a ser testado pronto e à mesma temperatura como o soro fisiológico banho. Pode usar em soluções individuais de serotonina (100 nM, 1microM), glutamato (1microM) e dopamina (1microM) feita em solução salina lagostas como substâncias começam a ser testados. </li><li> Permitir que o lagostim dissecados para sentar-se na solução de lagostas por cerca de 10 minutos para permitir que ele se adaptar ao choque de dissecção e exposição salina. As contrações peristaltismo lento do intestino grosso deve começar a ocorrer. </li><li> Uma vez que as contrações começam, registre o número de contrações que ocorrem em trinta segundos (note o tipo de contrações que ocorrem: ou seja, tipo o peristaltismo, ou espástica, ea direção de qualquer ondas peristálticas). Tabela 1: Contrações no Crayfish Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contrações </td><td> Tipo de Contrações </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Usando um piPette, retire o soro fisiológico dentro da cavidade do abdômen expostos os lagostins, e aplicar soro fisiológico contém a substância a ser analisada diretamente no intestino grosso. </li><li> Imediatamente após a adição da solução, registrar o número de contrações que ocorrem depois de trinta segundos e observe o tipo de contrações que ocorrem (ou seja, peristálticas, ou espástica). Tabela 2: Contrações com a exposição a compostos <table border="1"><tbody><tr><td> Composto testado </td><td> Concentração </td><td> Número de contrações </td><td> Tipo de Contrações </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Imediatamente após a gravação a resposta à substância de ensaio, lavar os tempos GI várias lagostas com solução salina normal. Deixe a preparação descansar por 5 minutos, enquanto a lavagem a cada 30 segundos com solução salina lagostim. </li><li> Com uma pipeta, colocar algumas salina contendo o composto próximo a ser examinado ou uma concentração variada de a substância última testado diretamente no intestino grosso. É melhor começar com uma concentração mais baixa e uma forma de trabalho para concentrações mais elevadas. </li><li> Imediatamente após a adição de cada nova substância ou a cada nova concentração, registre o número de contrações que ocorrem depois de trinta segundos e observe o tipo de contrações. </li></ol> 2.3.2) as forças de contração de gravação em preparações excisadas <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Setup <ol><li> Anexar o transdutor para o pod ponte. </li><li> Anexar o pod ponte para o PowerLab 26T. </li><li> Anexar o 26T PowerLab à porta USB no computador. </li><li> Abra LabChart7, clicando no ícone labchart7 na área de trabalho. <ul><li> A caixa de LabChart Welcome Center vai abrir. Fechá-la. </li><li> Clique em Setup </li><li> Clique em configurações de canal. Alterar o número de canais a 1 (parte inferior esquerda da caixa) empurrar OK. </li><li> Na parte superior esquerda do gráfico do conjunto de ciclos por segundo para cerca de 2k. Definir o volts (eixo y) para cerca de 500 ou 200 mV. </li><li> Clique no Canal 1 da direita do gráfico. Clique em Amplificador de Entrada. Garantir que as configurações: single-ended, ac acoplado, e invertido (inverte o sinal se necessário), e anti-alias, são verificados. </li><li> Para começar a começar a gravação, prima. </li></ul></li><li> Pick up a preparação e corte o trato gastrointestinal na junção entre o tórax eo abdômen. Em seguida, corte cuidadosamente em torno da parte telson da cauda. Remova o trato GI do crustáceo dissecados e colocá-lo no prato Sylgard. Há um vaso sanguíneo que corre ao longo do aspecto dorsal do trato gastrointestinal. Puxe cuidadosamente esta longe do trato gastrointestinal. Despeje salina lagostas frescas sobre o preparo. </li><li> Coloque o transdutor de força na pinça perto do crustáceo dissecados. </li><li> Ligar o transdutor de força no GI lagostas, como mostrado na Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: hindgut isolada da lagosta em soro fisiológico ligado ao gancho do transdutor de força </li><li> Aguarde até que o GI começa a se contrair, e empurre começar na LabChart7. </li><li> Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push &quot;parar&quot;, e adicionar um comentário rotulados &quot;, Saline só&quot;. Preencha a Tabela 4. Tabela 4: Contrações com o composto de interesse <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contrações </td><td> Amplitude das contrações (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Adicione o teste de compostos de interesse, e imediatamente pressione &quot;start&quot; na LabChart7. </li><li> Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push &quot;stop&quot; e adicionar um comentário diretamente sobre o arquivo gráfico de que substância foi adicionada e sua concentração. Preencha a tabela abaixo. Tabela 5: Contrações com composto _________ <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contrações </td><td> Amplitude das contrações (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Enxaguar a preparação com solução salina lagostas utilizando uma pipeta. </li><li> Adicionar outras substâncias ou várias concentrações de maneira similar. Imediatamente push &quot;start&quot; na LabChart7. </li><li> Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push &quot;parar&quot;, e adicionar um comentário e etiqueta diretamente sobre o arquivo gráfico que indica o compound utilizado e da concentração. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> 2.3.1 a partir do experimento, o gráfico do número de contrações de cada solução (serotonina, soro fisiológico, o glutamato) em função do tempo. Explicar todas as tendências. </li><li> 2.3.2 a partir do experimento, o gráfico do número de contrações de cada solução (solução salina, a serotonina, glutamato) versus a amplitude das contrações em mV. Explicar todas as tendências. </li></ol> 3.1) A medição da velocidade e força das contrações Para indexar as taxas de contrações sobre pode medir o tempo desde o início de um desvio para o início do próximo ou contar as deflexões total, durante um minuto ou dois. Os valores podem então ser colocada em termos de contrações por minuto ou por segundo, dependendo de como rápido eles estão ocorrendo. Para indexar a força das contrações uma medida relativa poderia ser usado para comparar diferentes condições. Sobre o arquivo salvo pode-se usar o marcador &quot;M&quot; e ir para a linha de base. Em seguida, use o cursor e mover-se para o pico da deflexão e anote o valor listado na parte superior direita da tela como um valor de delta (a diferença de M para o pico). Observe o cursor precisa ser mantida estacionária para a medida da mudança. Seguida, mova o M para a forma próxima onda de interesse e repetir a medida.

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+(APSGFLGMRamide,+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide)+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders.">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li><li>Wales, W., Sandeman, D. C., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mouthparts+and+gut.">Control of mouthparts and gut.</a> The Biology of Crustacea. 4, 165-191 (1982).</li><li>Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+cells+in+the+gut+of+the+shore+crab+Carcinus+maenas+immunoreactive+to+crustacean+hyperglycaemic+hormone+and+its+precursor-related+peptide.">Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide.</a> J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+1.+Analysis+of+hindgut+movements+and+receptor+activity.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+2.+Motor+output.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+3.+Structure+of+the+sixth+abdominal+ganglion+(6+A.G.)+and+associated+ablation+and+microelectrode+studies.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).</li><li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut.">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os detalhes fornecidos no filme e texto associados descrevem os principais passos necessários para registrar a atividade no intestino posterior do crustáceo in situ, assim como in vitro. Um dos objetivos do nosso relatório é aumentar a sensibilização para o potencial desta preparação no aluno executar laboratórios de investigação que ensinam conceitos fundamentais em fisiologia e farmacologia. Estas preparações podem ser utilizados para investigar uma série de perguntas experimental que levará a uma melhor compreensão das funções fisiológicas do intestino posterior. Os mecanismos subjacentes regulação das ondas peristálticas e sua reversão ainda não são conhecidos. Os mecanismos para maior controle do trato GI todo também não são totalmente compreendidos. A questão de como integrar os centros superiores a sua actividade com a saída autônomo que controla diretamente o sistema GI continua a ser um espaço aberto de investigação (Shuranova et al., 2006). Além disso, as capacidades osmorregulatório do intestino grosso crustáceos e as funções de osmorregulação durante o estresse de muda e ambientais não foram completamente elucidados. Há ainda muitas perguntas à espera de respostas nesta preparação.

<ol><li> Lagostim (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., EUA. </li><li> Padrão lagostas salina: Modificado de solução de Van Harreveld (1936). (Em mM) 205 NaCl; 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 e HEPES pH ajustado para 7,4. Glutamato, serotonina e dopamina são feitas em solução salina lagostim. Todos os produtos químicos são obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Ferramentas de dissecção: Fine # 5 pinças, tesoura fina, lâmina de faca, # 26002-20 pinos de insetos (todos obtidos a partir de Ferramentas Ciência Fine (EUA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Sylgard de fundo placa de Petri </li><li> Copos (para segurar soluções químicas) </li><li> Sinais elétricos são registrados na linha de uma interface PowerLab 26T para um computador (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). Nós usamos software padrão de ADInstruments chamado gráfico ou Âmbito. <li> Pod ponte para o transdutor de força (vagens Ponte diferentes são necessários para diferentes tipos de transdutores de força). </li><li> MLT0402 transdutor de força (2 gramas) é o grau de pesquisa, como mostrado no vídeo. MLT 0210 / D (10 mg a 25 gramas) ea MLT 500 / A (0-500g) são os transdutores de ensino graus (ADInstruments). </li></ol>

physiological experimentation with the crayfish hindgut: a student laboratory exercise

O objectivo do relatório é descrever as técnicas de dissecação para a preparação do intestino posterior lagostas e demonstrar como fazer gravações fisiológico com um transdutor de força para controlar a força de contração. Além disso, demonstrar como visualmente monitorar a atividade peristáltica, que pode ser usado como um bioensaio para vários peptídeos, aminas biogênicas e neurotransmissores. Esta preparação é passível de laboratórios de estudante em fisiologia e para demonstrar conceitos farmacológicos para os estudantes. Esta preparação tem sido usado por mais de 100 anos, e ainda oferece muito como modelo para investigar a geração e regulação dos ritmos peristáltica e para descrever os mecanismos subjacentes à sua modulação. Os ensaios farmacológicos e receptor sub digitação que foram iniciados há 50 anos no intestino grosso ainda contribuir para a investigação hoje em dia. Esta preparação robusta é bem adequado para os alunos de formação em fisiologia e farmacologia.

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Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Neste relatório, demonstram técnicas que podem ser usados ​​para investigar a biologia do intestino posterior lagostim. Nós mostramos como dissecar um abdômen lagostas e estudar a anatomia associados, fisiologia e modulação da atividade. A atividade peristáltica e força das contrações são medidos através de um transdutor de força.

Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

physiological-experimentation-with-crayfish-hindgut-student

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K visualizações.  University of Kentucky. Neste relatório, demonstram técnicas que podem ser usados ​​para investigar a biologia do intestino posterior lagostim. Nós mostramos como dissecar um abdômen lagostas e estudar a anatomia associados, fisiologia e modulação da atividade. A atividade peristáltica e força das contrações são medidos através de um transdutor de força.

Vídeo: Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Gravação de respostas comportamentais à Reflexão em Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Neurociência

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Potenciais de membrana, Responses Synaptic, circuitos neuronais, neuromodulação e Histologia Muscle Usando a lagosta: Exercícios Laboratório Student

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Muscular órgãos receptores no abdômen Crayfish: Um Exercício em Laboratório Student Propriocepção

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

VisualEyes: Um sistema de software modular para Experimentação Oculomotor

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propriocepção e tensão Receptores em Caranguejo Limbs: Exercícios Laboratório Student

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Measuring Oral Fatty Acid Thresholds, Fat Perception, Fatty Food Liking, and Papillae Density in Humans

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty acid receptors housed on taste cells. Previous research has shown that an individual&#39;s oral sensitivity to fatty acid, specifically oleic acid (C18:1) is associated with body mass index (BMI), dietary fat consumption, and the ability to identify fat in foods. We have developed a reliable and reproducible method to assess oral chemoreception of fatty acids, using a milk and C18:1 emulsion, together with an ascending forced choice triangle procedure. In parallel, a food matrix has been developed to assess an individual&#39;s ability to perceive fat, in addition to a simple method to assess fatty food liking. As an added measure tongue photography is used to assess papillae density, with higher density often being associated with increased taste sensitivity.

Oral chemoreception of fatty acids and the association with diet and fatty food preferences may enable the identification of mechanisms involved with the development of obesity and why dietary changes may be difficult for many individuals.

Medindo Oral Ácido Limites Fatty, Fat Percepção, gordos alimentares Gostar, e Papilas Densidade em seres humanos

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty ...