O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight and Research para prevenir a cegueira.

1. Dissecção do segmento anterior. <ol><li> Tecido escleral posterior ao limbo é apreendido com uma pinça 0,22 e do globo (globo ocular) é estabilizada. </li><li> Uma lâmina de microcirurgia é usado para fazer uma incisão linear na córnea a partir de limbo a limbo. </li><li> A Colibri 0,12 fórceps é então utilizado para captar a córnea na incisão. </li><li> O fluido da câmara anterior é então absorvida com uma lança Weck-Cel cirúrgico. </li></ol> 2. Evisceração lente. <ol><li> A Colibri 0,12 fórceps segurando a córnea é usada para estabilizar o mundo. </li><li> Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é inserido atrás da lente em direção ao aspecto posterior do globo. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, o que empurra a lente para a frente através da incisão da córnea, deixando a parede do olho intacto. O vítreo aparece como um gel transparente e é parcialmente aderente à lente. </li><li> O tecido vítreo-lente é então colocada em um tubo de centrifugação filtrado contendo 20 microlitros de cocktail inibidor da protease (Roche) dissolvido em PBS. </li></ol> 3. Evisceração retina. <ol><li> Continue para estabilizar o mundo com 0,12 forceps Colibri agarrar a incisão na córnea. </li><li> Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é colocado como muito posterior ao globo possível, perto do nervo óptico. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, que empurra a retina para a frente através da incisão da córnea. O vítreo aparece como um gel transparente aderente à retina. A retina é visualizado como um amarelo tecido vascularizado,. Quaisquer tiras de tecido pigmentada pode ser desfeito, com uma pinça. </li><li> O tecido da retina vítreo é então colocado no tubo de centrifugação filtrada contendo o tecido lente vítrea. </li></ol> 4. Filtrada centrifugação. <ol><li> O tubo de centrifugação filtrado é colocado em uma centrífuga de bancada. Giram a 14.000 x G por 12 minutos. </li><li> Aspirar o eluente da câmara baixa, que é o vítreo. A retina permanece na câmara superior. Essas amostras podem ser utilizados para estudos de proteínas. </li></ol> 5. Resultados representante As amostras vítreas foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 2). As amostras também foram utilizados para um ensaio de atividade enzimática (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Rato diagrama de olho. Transversal esquemático do olho humano e do rato mostra o volume vítreo relativa menor no olho do rato, devido à sua maior lente. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Unidimensional SDS-PAGE do vítreo mouse e retina. Perfis de proteínas do vítreo mouse, 13,6 mg / mL (pista 1) e retina, 11,35 mg / mL (faixa 2). Eletroforese em gel foi realizada em 150 kV por 45 minutos, corados com Flamingo gel fluorescente mancha e visualizado através de um sistema de VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Superóxido dismutase atividade enzimática (SOD) no rato e vítreo humano. Medição da atividade SOD total (SOD atividade colorimétrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) foi realizada em vítreo e retina coletados por evisceração de camundongos DBA e albino. Este resultado foi comparado à atividade SOD no núcleo vítreo humano e retina humana coletados de post-mortem olhos de doadores humanos para determinar a atividade relativa. Diluído amostras de núcleo vítreo foram aspirados manualmente utilizando uma agulha 23 gauge, 11 e retina foram coletados por floração o olho e cortar o tecido de distância do complexo EPR ​​/ coróide. Embora o ensaio não faz distinção entre as isoformas da SOD, a atividade SOD vítreo é provável que refletem SOD3, uma vez que é apenas a isoforma extracelular 12 A atividade de SOD retina é susceptível de reflectir todas as isoformas da SOD três:. SOD1 intracelular, SOD2 mitocondrial, e extracelulares SOD3. 12 Porque altamente sensível ensaios enzimáticos, incluindo este ensaio SOD, a possibilidade de contaminação cruzada de proteínas é possível e requer um estudo mais aprofundado. Barras de erro representam SEM.

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	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. 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Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Associação para a Investigação e Visão em Oftalmologia declaração para o uso de animais em oftálmica e Vision Research.

Camundongos transgênicos são um importante modelo para a investigação de doenças da retina e vítreo-retinianas. 6-10 O corpo vítreo mouse, no entanto, compreende uma proporção significativamente menor do olho em relação ao vítreo humano devido ao grande lente no olho do rato. 5 Isso faz com que difícil isolar e purificar o vítreo mouse. Compreensão das mudanças proteína associada com o vítreo durante doenças como a retinopatia diabética proliferativa, relacionadas com a idade degeneração macular, uveíte e descolamento de retina vai dar dicas sobre os mecanismos pelos quais o progresso. Este protocolo experimental visualizadas fornece um meio para obter e purificar o corpo vítreo do mouse e maximizar a produção de proteína para as análises enzimáticas e proteômica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Microsurgical Lâmina </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Pinça Castroviejo Sutura </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrolador Centrífuga Filtro Ultracel YM-100 ou YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> Atividade SOD Kit de Ensaio Colorimétrico </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel cirúrgica lanças </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Protease cocktail inibidor </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo gel fluorescente mancha </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

Enquanto a retina do rato tem emergido como um importante modelo genético para a doença hereditária da retina, o vítreo do mouse continua a ser explorado. O vítreo é uma matriz extracelular altamente aquosa que recobre a retina, onde intra-ocular, bem como proteínas extraocular acumulam durante a doença. 1-3 interações anormais entre vítreo e retina subjazem diversas doenças, como descolamento de retina, retinopatia diabética proliferativa, uveíte e Vitreorretinopatia proliferativa 1. , 4 O volume vítreo relativa do mouse é significativamente menor do que o vítreo humano (Figura 1), uma vez que a lente do mouse ocupa quase 75% do seu olho. 5 Isso fez com que estudos bioquímicos do vítreo do mouse desafiador. Neste artigo de vídeo, apresentamos uma técnica para dissecar e isolar o vítreo da retina do rato, que vai permitir o uso de modelos de ratos transgênicos para definir mais claramente o papel dessa matriz extracelular no desenvolvimento de doenças vítreo-retinianas.

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Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

evisceration-of-mouse-vitreous-and-retina-for-proteomic-analyses

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Biology

28.8K visualizações.  University of Iowa. A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.