Este trabalho foi financiado pelo R01 DK078161 de NIDDK (LO), bolsas de pós-doutorado da American Heart Association (AB), as Fundações Wenner-Gren da Suécia e Fysiografiska Kungliga Sällskapet, Lund, Suécia (UB). Apoio adicional foi fornecido pelo Maine Medical Center Research Institute instalações do núcleo de Histopatologia, Bioinformática e FACS (apoiado por 2P20RR18789-06) eo Biotério MMCRI.

1. Preparando Reagentes para Digestão Kidney <ol><li> 1,5 ml de colagenase 0,25% A (w / v) e 1% de solução pancreatina digerir (w / v) serão necessários para a extração de células da zona nefrogênica (NZCs) de 8 E17.5 rins. Porque Pancreatina leva aproximadamente duas horas para dissolver em temperatura ambiente, o suficiente digerir solução para o maior número de rins embrionários esperado deve ser feita antes do experimento. Prepare digerir solução primeiramente adicionando 25 mg de colagenase A a 10 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS) em 15 ml claro, tubo de centrifugação estéril. É fundamental que o DPBS não contém cálcio ou magnésio como isso irá interferir com a digestão enzimática. Misturar a solução em um nutator por 10 minutos para dissolver colagenase A. Adicionar 100 mg de pancreatina a colagenase Uma solução dissolvida e misture em um nutator por pelo menos 2 horas. Alternativamente, colagenase A / pancreatina solução para a análise pode ser misturado em um nutator overnight a 4 ° C. É recomendável que você usar uma máscara, como colagenase A e pancreatina dispersar facilmente para a atmosfera durante a pesagem e pode irritar as vias nasais. </li><li> Prepare a 5% de soro fetal bovino (FBS) solução (v / v) em solução salina tamponada de Hank (HBSS). Inverter para misturar. 1 ml para cada tubo de 8 rins serão necessários. </li><li> Prepare meio de cultura, completando meio de soro queratinócitos livre com glutamina 1% (v / v) e 1% penicilina-estreptomicina (PenStrep) (v / v). </li><li> Revestimento estéril plano de fundo de poliestireno placas de cultura de tecido (96, 48, 24 ou 6 bem) com a solução de fibronectina humana a uma concentração de 5 mg por cm 2 de superfície de crescimento. 5 mg de pó de fibronectina é ressuspendido em 5 ml de H 2 O. estéril Este é diluído 1:25 em DPBS estéril sem cálcio ou magnésio e 250 ml é adicionado a cada poço de uma placa de 24 poços. As placas são então incubadas com solução de fibronectina em temperatura ambiente por uma hora seguido por uma hora a 4 ° C. Por outro lado, as placas podem ser incubadas overnight a 4 ° C. A solução é, então, aspirado em uma capela de fluxo laminar antes da adição de médio / células. </li></ol> 2. Rins de dissecação e remoção Cápsulas (feito à temperatura ambiente) <ol><li> No E17.5, o sacrifício da mãe através de um procedimento aprovado pelo seu Animal Care Institucional e Comitê de uso, remover o útero, e colocá-lo numa placa de Petri contendo DPBS com cálcio e magnésio. Sob um microscópio de dissecação, use relojoeiros &#39;fórceps para remover cada embrião do útero e decapitar cada embrião. Uma vez que toda a ninhada está fora do útero, a transferência dos embriões para uma placa de Petri limpa contendo DPBS suficiente com cálcio e magnésio para cobrir inteiramente os embriões deixando para trás tanto sangue e restos de tecido possível. </li><li> Utilizando uma pinça, faça uma incisão circunferencial na parede abdominal do embrião no nível do umbigo. Em seguida, coloque o embrião em sua parte traseira, fixá-lo na altura dos ombros com um conjunto de pinças, e remover os órgãos internos dos pulmões até a bexiga usando o outro conjunto de fórceps. Com a prática isto pode ser feito em um único movimento. Os rins devem ser anexados na parte de trás da massa de órgãos. Se os rins não permanecer solidários com os órgãos eviscerados, eles podem ser cuidadosamente removida da parede do corpo dorsal. Rins que foram danificados durante o processo de dissecção deve ser descartada como eles vão contaminar a cultura final com tipos de células inadequado. </li><li> Provocar suavemente afastado os rins do resto dos órgãos, tendo o cuidado de manter os rins ligados uns aos outros. Segure o tecido entre os rins com um conjunto de pinças e agarra a glândula adrenal anexado a um dos rins com a pinça outros. A glândula adrenal deve ser anexado à cápsula renal. Descascar delicadamente a glândula adrenal e da cápsula de distância ao redor do exterior do rim, semelhante ao descascar uma banana. Tome cuidado para não dividir o rim ao meio enquanto peeling, e não se esqueça para não danificar o tecido renal por baixo da cápsula. Remova cuidadosamente a cápsula restantes, bem como o ureter se ele ainda está conectado. Repita com o rim remanescente. </li><li> Use uma pipeta de transferência de corte para colocar os rins em um tubo de poliestireno 5 ml de HBSS. Repita os passos de 2,2-2,4 para cada embrião. Rins podem ser agrupados de 8 por tubo. Com remoção de dissecação prática, e da cápsula levará 2-3 minutos por embrião. </li></ol> 3. A digestão enzimática de Rins (todas as etapas à temperatura ambiente exceto quando indicado) <ol><li> Remoção da solução HBSS de 5 ml contendo tubos de rins com uma pipeta, enquanto cuidadosamente evitando o contato com os rins. Imediatamente adicionar 1,5 ml de colagenase A / pancreatina solução para análise para o tubo de 5 ml contendo rins antes de passar para a próxima amostra. Repita o procedimento para cada tubo de rins. </li><li> Colocar os tubos com a enzima / rim digere em um nutator em uma pré-aquecido a 37 ° C incubadora por 15 minutos. 2 minutos antes doconclusão do sumário, adicionar 3 mL de DNase (1 U / ml) para um novo tubo de poliestireno 5 ml para cada digerir sendo realizada. </li><li> Remover rapidamente digere da incubadora, adicionar 75 mL de FBS e inverter 3 vezes para misturar. Deixe descansar no banco por 2 minutos. </li><li> Transferência de 1,4 ml da suspensão de células para o tubo de poliestireno 5 ml contendo DNase (1 U / ml), deixando os restantes 0,2 ml suspensão de células e os rins para trás. O mL de solução 0,2 extras deixado para trás irá conter impurezas como matriz extracelular. </li><li> Mix suspensão celular / DNase em um nutator em uma pré-aquecido 37 ° C incubadora por 10 minutos. </li><li> Remover rapidamente suspensões de células da incubadora ea transferência de cada um para um tubo Eppendorf 1,5 ml. Suspensões de células de spin em microcentrífuga a 325 g por 5 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante de pellet celular e pellet ressuspender em 1 ml de 5% FBS / HBSS, pipetando para cima e para baixo 5 a 6 vezes. Cap cada tubo antes de passar para a próxima amostra. </li><li> Girar suspensões de células em uma microcentrífuga a 325 g por 5 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 0,5 ml de meio de soro queratinócitos livre (KSFM) com aditivos para cada tubo e tubo de tampa antes de passar para a próxima amostra. Depois médio foi adicionado em todos os tubos, delicadamente ressuspender cada pellet de células por pipetagem cima e para baixo 5-6 vezes com uma micropipeta de 1 ml. Combine todas as suspensões de células em um novo tubo de poliestireno 5 ml. </li><li> Pré-molhada dois 40 micron célula filtro-caps colocado em um tubo de poliestireno 5 ml de fundo redondo com KSFM por amostra. Passe suspensões de células através de uma tampa de filtro de célula, transferindo com uma micropipeta de 1 ml. Evite tocar o filtro com a ponta da pipeta. Colete de fluxo e repita filtração através da tampa do filtro segundo. Remova a tampa do filtro de células e substituir por uma nova tampa de um tubo de poliestireno normais 5 ml. </li><li> Contagem de células com hemocitômetro ou outra célula dispositivo de contagem e células transferência para poços de uma placa de cultura fibronectina revestido a uma densidade de 100.000-200.000 células por cm 2, diluindo conforme necessário com KSFM com aditivos. Geralmente, nós recuperamos cerca de 4.5x10 6 células por 10 maca embrião. </li><li> Incubar as células a 37 ° C incubadora umidificada com 5% de CO 2. </li><li> Permitem que as células para recuperar e anexar por 2-4 horas em média antes da estimulação com reagentes adicionais. Estimulam as células com o composto de interesse para 1-48 horas. Purificar RNA para análise PCR usando o Qiagen RNeasy Micro Kit seguir as instruções do fabricante ou siga as instruções abaixo para fluorescente immunostain as células. </li></ol> 4. Preparando Reagentes para fixação das células e imunocoloração <ol><li> Prepare PFA 4%: Dissolver paraformaldeído 4% em PBS (v / v) a 55 ° C com agitação regular. Arrefecer à temperatura ambiente antes de usar. Esta solução é tóxico e deve ser descartado em contentores de lixo designados. </li><li> Prepare a solução de permeabilização adicionando Triton X-100 a PBS para obter uma solução 0,3% (v / v). </li><li> Prepare uma solução de 5% de bloqueio no PBS com soro da mesma espécie que foi usada para elevar o anticorpo secundário a ser usado. Por exemplo, se você vai detectar um anticorpo de coelho contra o antígeno do alvo com um burro anti-coelho Alexa Fluor 568, preparar uma solução contendo soro bloqueio burro de 5%. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare a solução de anticorpo primário, adicionando a concentração adequada de anticorpos a 5% de solução de bloqueio. </li><li> Prepare a solução de anticorpo secundário imediatamente antes da utilização. Adicionar anticorpos fluoróforo conjugado na concentração recomendada pelo fabricante juntamente com o contracorante nuclear DAPI e outros marcadores organela como phalloidin a 5% de solução de bloqueio. Se o armazenamento for necessário, manter a solução no escuro a 4 ° C até o uso. </li><li> Prepare glicerol a 50% / solução de PBS (v / v) para o armazenamento de células imunocoradas. Alternativamente, Vectashield pode ser usado. </li></ol> 5. Fixação de Células e imunocoloração <ol><li> O protocolo a seguir é projetado para a fixação e coloração das NZCs em uma placa de 24 poços. Volumes indicados são para um único poço. Reagentes devem ser cuidadosamente pipetado durante todas as etapas para evitar desprendimento de células, e agitação placa não é recomendado nas etapas de incubação. </li><li> Remova cuidadosamente com uma média 1 ml micropipeta e adicionar 0,5 ml de PFA 4% a células cultivadas em anexo. Incubar por 15 minutos sem perturbações à temperatura ambiente. </li><li> Remover PFA 4% e adicionar 0,5 ml por poço de solução de permeabilização. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remoção da solução de permeabilização e enxaguar levemente duas vezes com 0,5 ml de PBS por lavar. </li><li> Adicionar 0,5 ml de solução de bloqueio e incubar em temperatura ambiente por 60 minutos. </li><li> Remoção da solução de bloqueio e adicionar 0,225 ml de solução de anticorpo primário. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 2 horas ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remoção da solução de anticorpo primário e gentilmente riNSE duas vezes com 0,5 ml de PBS por lavar. </li><li> Adicionar 0,225 ml de solução de anticorpo secundário. Incubar placa no escuro em temperatura ambiente por 60 minutos. </li><li> Remoção da solução de anticorpo secundário e enxaguar levemente duas vezes com 0,5 ml de PBS por lavar. </li><li> Adicionar 0,3 ml de glicerol 50% / solução de PBS (v / v) ou Vectashield suficiente para cobrir parte inferior da superfície bem. </li><li> Células de imagem com microscópio de epifluorescência ou armazenar embrulhados em papel a 4 ° C. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. NZCs foram purificados a partir de embriões E17.5, banhado em 200.000 células por cm 2 e incubados a 37 ° C para um total de 24 horas. As células foram fotografadas pela contraste de fase com um microscópio Leica DM IRB invertida antes da coloração de imunofluorescência. (A) 20X visão de contraste de fase de NZCs após 24 horas de cultura. (B) As células foram fixadas e coradas usando um anticorpo anti-coelho PAX2 específico para células progenitoras néfron (vermelho) e um secundário Alexa Fluor 568 conjugado burro anti-coelho. Nota núcleos azul contrastado com DAPI. (C) visão de contraste 40X fase de um grupo de progenitores néfron (centrado) após 24 horas de cultura. (D) a imagem de 40X NZCs isolado de LacZ + embriões da linhagem LacZ Foxd1, que expressa β-galactosidase sob o controle do promotor Foxd1. Foxd1 se expressa na população de células do estroma dentro da zona nefrogênica do rim em desenvolvimento. As células foram coradas com a F-actina marcador phalloidin (Oregon verde principal conjugado), o DAPI nuclear mancha (Azul) e de coelho anti-β-galactosidase (secundário - Alexa Fluor burro anti-coelho 568) para a detecção de células do estroma Foxd1 + ( vermelho).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, descrevemos um método para isolar e cultivar células da zona nefrogênica do rim embrionário. É o desenvolvimento de um método inicialmente publicado como parte de um estudo dos efeitos da BMP7 tratamento em células da zona nefrogênica (Blank et al., 2009). No estudo inicial, uma série de experimentos para caracterizar os tipos de célula representada dentro da população NZC foram realizados. Resumidamente, a purificação da NZCs dos repórteres genética para o estroma cortical ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Desenvolvimento embrionário dos rins tem sido extensivamente estudado tanto como um modelo para a interação epitélio-mesenquimal em organogênese e conhecer melhor as origens da doença renal congênita. Mais recentemente, a possibilidade de direcção ingênua células-tronco embrionárias para destinos nefrogênica tem sido explorado no campo emergente da medicina regenerativa. Estudos genéticos no rato identificaram vários caminhos necessários para o desenvolvimento do rim, e um catálogo global da transcrição de genes do órgão foi recentemente gerado <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , proporcionando reguladores candidato inúmeras funções essenciais de desenvolvimento. Organogênese dos rins de roedores pode ser estudado em cultura de órgão, e muitos relatórios têm usado essa abordagem para analisar os resultados de qualquer aplicação de proteínas candidato ou derrubando a expressão de genes candidatos usando siRNA ou morpholinos. No entanto, a aplicabilidade da cultura de órgãos, para o estudo de sinalização que regula a haste / diferenciação de células progenitoras contra renovação no rim em desenvolvimento é limitado como órgãos de cultura contêm uma matriz de difusão compacto extracelular limitando de macromoléculas e partículas de vírus. Para estudar a sinalização celular eventos que influenciam a haste / nicho de células progenitoras no rim, temos desenvolvido um sistema de célula primária que estabelece a zona nefrogênica ou nicho de células progenitoras do desenvolvimento do rim vivo ex isoladamente o indutor da diferenciação epitelial. Usando a digestão enzimática limitada, as células da zona nefrogênica pode ser seletivamente liberada de desenvolver rins em E17.5. Após filtração, essas células podem ser cultivadas como uma monocamada irregular utilizando condições otimizadas. Análise gene marcador demonstra que essas culturas contêm uma distribuição de tipos de células característica da zona nefrogênica in vivo, e que mantêm a expressão do gene marcador apropriado durante o período de cultura. Estas células são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, o que facilita muito o estudo do candidato-tronco / progenitoras efeitos regulador celular. Parâmetros de células biológicas básicas, como a proliferação e morte celular, bem como alterações na expressão de marcadores moleculares característicos de néfron tronco / progenitoras células in vivo pode ser utilizado com sucesso como os resultados experimentais. Trabalhos em curso no nosso laboratório, utilizando esta técnica celular romance principal objetivo de descobrir os mecanismos básicos que regem a regulação da auto-renovação versus diferenciação no néfron tronco / progenitoras das células.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

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Research

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Biology

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Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Biologia

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolamento e Cultura da Avian embrionárias Células Progenitoras Valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...