A ativação das células epiteliais parietal é um fator-chave no desenvolvimento do tecido cicatricial no glomerulus do rim. Usando esse método, podemos estudar os processos celulares envolvidos nesta ativação e, com sorte, encontrar opções de tratamento para retardar ou até mesmo parar a progressão da doença. A principal vantagem de nossa técnica é que usamos células primárias que crescem diretamente do glomeruli isolado.
Depois de liberar os rins, como descrito no manuscrito do texto, segure o rim com os fórceps cirúrgicos e use outro par de fórceps para retirar as cápsulas renais. Depois disso, coloque os rins nos poços de uma placa de seis poços que cada um contém dois mililitros de HBSS e coloque a placa de cultura no gelo. Primeiro, transfira os rins para uma placa de Petri de 100 milímetros e use dois bisturis para pica-los em pequenos pedaços que são aproximadamente de um a dois milímetros.
Mantenha as peças de rim picadas molhadas com HBSS. Em seguida, coloque as peças nos rins em cima de uma peneira metálica de 300 micrômetros e pressione o rim através da peneira usando o êmbolo de uma seringa de 20 mililitros. Enxágüe repetidamente a peneira com HBSS no meio e use uma pipeta sorológica para coletar o fluxo e transferi-lo para uma placa de Petri limpa.
Use um bisturi para raspar tudo o que resta na parte inferior da peneira e transferi-lo para o rim coletado homogeneizar. Enxágüe o rim homogeneizar através de uma peneira de 75 e 53 micrômetros com HBSS. Em seguida, lave as duas peneiras com HBSS para remover todas as estruturas menores.
Recolher as estruturas renais e o material que permaneceram nas peneiras lavando a superfície superior de cada um com DMEM suplementado com soro de bezerro fetal de 20% e transferir o material para os poços de uma micropla placa de apego ultra-baixa de seis poços. Leve a microplacão de fixação ultra-baixa para um microscópio de luz invertida e use uma pipeta de 20 microliteres que recolheu glomeruli encapsulado e ou descapsulado. Depois de pegar um único glomerulus na ponta da pipeta, adicione um novo meio DMEM sem material renal coletado na mesma ponta de pipeta a um volume de 20 microliters.
Transfira o glomerulus único com o meio DMEM para o centro de um poço de uma placa de cultura celular de 24 poços e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a fixação do glomerulus ao centro do poço. Após a incubação, o glomerulus será anexado ao centro do poço. Adicione cuidadosamente 500 microliters de meio basal endotelial suplementados com um kit de fator de crescimento e um adicional de 5% FBS e 1%penicilina e estreptomicina para cada poço.
Cultura o glomeruli único a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis dias. Após seis dias de incubação, use um microscópio de luz invertida digital para tirar imagens e analisar o crescimento glomerular. Usando um software de análise de imagem, determine a área de superfície do crescimento glomerular abrindo um dos arquivos de imagem com uma barra de escala.
Desenhe uma linha reta na barra de escala e clique em Analisar e, em seguida, meça para determinar a distância em pixels. Para determinar a escala, clique em Analisar e Definir escala e inserir a distância conhecida em pixels, a distância conhecida e a unidade de comprimento. Clique em Ok quando terminar.
Clique em Analisar e Definir Medidas. Em seguida, verifique as opções de Área e Etiqueta de Exibição. Clique em Ok quando terminar.
Em seguida, desenhe uma seleção à mão livre em torno do crescimento glomerular. Clique em Analisar e medir para exibir uma tabela de resultados, que contém a área de crescimento superficial na escala determinada anteriormente. neste estudo, as células epiteliais parietal glomerulares superfaturadas de glomeruli encapsulada são isoladas de rins de camundongos, cultivadas e analisadas.
Imagens representativas de microscopia luminosa mostram os crescimentos glomerulares em diferentes pontos de tempo durante a cultura após o glomerulus ser isolado dos rins do rato. Para validar que as células de crescimento são células epiteliais parietal, glomeruli descapsulado também são isolados e cultivados por seis dias. Glomeruli decapsulado não mostra crescimento celular durante este período de incubação.
A coloração imunofluorescente é então realizada para diferentes marcadores de células epiteliais parietal, marcadores específicos do local fotográfico, bem como marcadores celulares endoteliais. Os resultados validam que as células que se sobressalam, de fato, são células epiteliais parietal. Glomeruli associado a partir de camundongos knockout CD44 mostram um número reduzido de células em crescimento, bem como uma área de superfície reduzida de crescimento glomerular em comparação com o glomeruli isolado de ratos do tipo selvagem.
Isso sugere um papel importante para o CD44 na ativação de células epiteliais parietal. Usando essa técnica, também é possível estudar os efeitos em drogas na ativação de células epiteliais parietal. Isso pode ser feito tratando o glomeruli isolado com a droga de sua escolha e para analisar as diferenças no crescimento celular e migração celular.
