A cultura de órgãos renais e organelas derivadas de células-tronco programadas fornecem excelentes maneiras de estudar mecanismos por trás do desenvolvimento renal e doenças. No entanto, o sistema atual de cultura de órgãos não fornece fluxo sanguíneo para o rim. Devido a isso, a razão pela qual os modelos atuais estão incompletos e não conseguem recapitular a função principal do rim, que é a filtragem sanguínea.
Nesta publicação, apresentamos um protocolo aprimorado para cultivo e visualização de rins embriões e organoides na membrana corioallantóica do embrião de frango. Em nossa nova configuração experimental, sobrepomos os rudimentos renais transplantados na CAM com reservatórios permeáveis que estão cheios de meio de cultura. Este protocolo aumenta significativamente a sobrevivência dos rudimentos renais e também das células endoteliais intrínsecas.
O método permite o fluxo sanguíneo para o glomerulus em desenvolvimento. Recentemente publicamos também um novo método de cultura de órgão de direção fixa que oferece imagens de lapso de tempo 3D confocal de alta resolução. O método forneceu condições ideais para imagens confocal de longo prazo dos organoides e rudimentos de órgãos.
Na abordagem, compactamos suavemente o tecido entre um deslizamento de tampa de vidro e uma membrana permeável. Aqui mostramos como as placas projetadas sob medida são feitas e como os experimentos culturais são configuradas. Assim, nesta publicação apresentamos uma técnica de cultura de tubos de organela renal aprimorada.
Este método oferece uma melhor maneira de modelar a organela gênese e realizar imagens de alta resolução para estudar rins embrionários e organoides renais ex vivo. Dependendo do seu experimento, faça contrassos de células de transferência projetadas para placas de seis ou 12 poços. Corte as laterais da pastilha usando uma ferramenta Dremel para criar um anel plástico de dois milímetros de altura com uma membrana permeável ligada a ele.
Polir as bordas do anel de swarf com um bisturi ou uma faca afiada. Esterilize os mini reservatórios em 70% de etanol por pelo menos uma hora. Em seguida, lave os mini reservatórios em autoclave por água destilada e seque-os em um capô laminar.
Enxágüe os mini reservatórios em PBS e meio de cultura. Coloque o reservatório em uma placa de petri em cima do nosso meio de cultura com a membrana voltada para cima. Disponha rins embrionários ex vivo dissecados ou organoides renais na membrana.
Evite deixar muito líquido ao redor das amostras e deixe-as presas de duas a 24 horas em uma incubadora de cultura celular. O transplante exenal é feito à membrana corioallantóica de um frango ex-embrionário ex-ovo de oito dias de idade. Transfira os mini reservatórios para que a membrana esteja cobrindo o enxerto.
Coloque-os na periferia da CAM para que não estejam cobrindo o embrião. Em seguida, adicione o meio de cultura aos mini reservatórios. Cultive as amostras em CAM de frango por nove dias como máximo.
Substitua o meio de cultura nos mini reservatórios diariamente. A vascularização das amostras já pode ser observada de 24 a 48 horas após o transplante. Para fazer as placas personalizadas projetadas de seis poços para a cultura fixa.
Você precisa começar perfurando furos de 20 milímetros na parte inferior da placa usando uma máquina de perfuração com uma broca adequada. Em seguida, polir as bordas dos orifícios na parte superior da placa. Por fim, esterilize as placas em 70% de etanol por pelo menos uma hora.
Em seguida, lave as placas em autoclave por água destilada e seque-as na capa lemiar. Lave a tampa de 22x22 milímetros em 70% de etanol e deixe-os secar completamente. Cole o deslizamento da tampa em cima de um orifício na parte inferior de um poço usando cola de tecido.
Após a secagem, inspecione as placas sob microscópio estéril e remova o excesso de cola. Primeiro, misture uma alíquota de contas de poliestireno com um volume igual de hidrogênio. Coloque a inserção transfill sob um microscópio dissecando com membrana voltada para cima e organize os rins na membrana.
Adicione uma gota de mistura de contas de hidro gel ao lado dos rins cuidadosamente. Vire a inserção transfill para que a membrana e os rins estejam voltados para baixo. Em seguida, coloque cuidadosamente a inserção em nosso poço de placa de seis poços projetada sob medida.
Empurre a pastilha muito suavemente para dentro do poço. Siga o grau de achatamento do microscópio até que o rim esteja no nível das contas. Mantenha a inserção ligeiramente pressionada no poço com uma mão e fixe-a na placa derretendo plástico em três pontos na periferia da pastilha com um ferro de solda.
Adicione dois mililitros de cultura no poço através de uma abertura ao lado. Ao iniciar uma imagem de lapso de tempo, transfira a placa para a incubadora no estágio de um microscópio invertido. Nosso protocolo de captura cam modificado permite vascularização altamente eficiente de organoides renais e rins embrionários.
Muitos reservatórios que contêm cultura média fornecem tecido de doadores e o protege da secagem durante o período inicial de tempo em andamento do vascularizaton. Este filme mostra o fluxo de células sanguíneas de frango em um centro renal de rato embrionário enxertado em cam de frango e cultivado por sete dias. Este painel de figuras mostra que nosso método de cultura CAM melhorado fornece condições permissivas para as células endoteliais derivadas renais.
As figuras A e B mostram que os rins embrionários cultivados por cinco dias em dias de cultura de intervalo foram enxertados no CAM de frango por cinco dias. A coloração com o anticorpo CD-31 específico do camundongo mostra que a rede celular endotelial do centro renal enxertado na CAM é mais extensa do que no controle do lado esquerdo. Na figura C vemos que os vasos sanguíneos do rato manchados com anticorpo CD-31 específico do rato e isso é o mais com vasos sanguíneos de frango.
As figuras D e E mostram criosecções de rins embrionários de camundongos cultivados na cultura de viagem ou cam de frango por cinco dias e manchados com CD-31 e Hoechst. A vasculatura glomeruli é mais madura em rins cultivados em CAM de frango do que em culturas de controle. A Figura F mostra um rim embrionário de rato cultivado na CAM de um frango GFP transgênico por sete dias.
As células endoteliais do rato estão manchadas com anticorpo CD-31 e podemos observar que a vasculatura nos rins de camundongos xenotransplantados é principalmente, mas não exclusivamente derivada do rato. A nova cultura de direção fixa permite a cultivo de rins embrionários e organoides em uma distância fixa restrita. Em uma cultura de viagem tradicional, os órgãos cultivados são colocados em um filtro que é mantido em uma interface média de ar por uma grade metálica.
Este método permite boas condições para o desenvolvimento e crescimento, mas não é ideal para imagens. Na cultura de direção fixa, o órgão cultivado é pressionado entre um fundo de vidro do prato e uma membrana e a espessura dele é controlada pelas contas de poliestireno que trabalham como espaçadores aqui. Os órgãos em desenvolvimento podem ser imagens através do vidro da tampa dando a visão melhorada do órgão.
Este painel de figuras mostra que os rins embrionários e organoides renais podem ser cultivados no método de cultura de direção fixa. Imagens de campo brilhante de rins embrionários e organoides renais no sétimo dia mostram desenvolvimento normal. Na figura C, a expressão GFB foi ativada nos nefrões em desenvolvimento de um organoide renal pela Figura D mostra um rim com trauma uma mancha no broto etértrico e seis duas manchas marcando as células precursoras do nefron.
As figuras E e F apresentam o rim do rato cultivado por 12 dias. O trauma e a coloração de nefron mostram o broto euretérico e podocites. O filme também apresenta um rim embrionário de MTMG, origem cree de Taiwan, onde o credo de Taiwan induz a expressão GFB em células endoteliais.
Podemos ver que as células endoteliais renais estão presentes no rim embrionário em desenvolvimento e a rede endotelial também pode se desenvolver no método de cultura. No painel à direita, você pode ver como as células endoteliais migram para a fissura vascular de um nefron estágio em forma de S. Aqui apresentamos o protocolo aprimorado para xenotransplante de organoides renais e rins embrionários para cam de frango.
Este protocolo aumenta significativamente a sobrevivência dos rudimentos renais e também suas células endoteliais intrínsecas. O método permite o fluxo sanguíneo para o glomerulus em desenvolvimento. O outro protocolo aqui apresentado é o método de cultura de órgãos de direção fixa que melhora a qualidade da imagem e ajuda a estudar a organela gênese no nível único celular.
As imagens de alta resolução são adequadas para segmentação celular automatizada e estudo baseado em computador do comportamento celular em organoides renais e culturas renais.
