Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação (NIDCD) Programa intramuros.

1. Transfecção neurônio <ol><li> Cultura embrionária neurônios dia 18 (E18) de ratos do hipocampo em poli-d-lisina revestido Mattek de 35 mm com fundo de vidro pratos 1. Em 16-18 dias in vitro (DIV), os neurônios transfecção usando o Clontech CalPhos Kit Transfection mamíferos. Primeiro, substituir o meio de cultura com 1,5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Modified Dulbecco Eagle Medium</a> (DMEM) por 35 mm prato 0,5 horas antes da transfecção. Salvar o meio de cultura original em um tubo estéril 15 ml para uso posterior (passo 1.6). </li><li> Misturar 10 mg DNA pEGFP-N1 do plasmídeo com estéril H 2 O (Clontech) e 12,4 mL solução de cálcio 2 M (Clontech) para um volume total de 100 l. </li><li> Adicione a mistura a partir do passo 1.2) para 100 l 2 × HBS gota a gota enquanto vórtex 2 × HBS em velocidade média. </li><li> Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20 minutos e depois adicione a mistura final a partir do passo 1.3) em DMEM-incubadas neurônios. </li><li> Coloque os neurônios de volta para a 37 ° C incubadora de 1-1,5 horas. </li><li> Remover o fosfato de cálcio contendo meio, em seguida, lavar as células com DMEM três vezes. Antes de devolver o prato de cultura para a incubadora, troca o meio DMEM com o meio de cultura original. </li></ol> 2. FRAP experimento em uma coluna <ol><li> Neurônios são usados ​​para o experimento FRAP 2-4 dias após transfecção. </li><li> Substituir o meio de cultura a partir do 35-mm prato fundo de vidro, por acrescentando imediatamente pré-aquecido solução Tyrode, que contém (em mM) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Glucose 10, Glycine 0,005, CaCl 2 2,6, e MgCl 2 1.3 (pH ajustado para 7,4 com NaOH). </li><li> A Zeiss LSM 710 microscópio confocal é usado para o experimento FRAP. O sistema TempModule Zeiss é usado para controlar a temperatura (37 ° C), a umidade e as emissões de CO 2 (5%) do sistema de trabalho. Certifique-se que o CO 2 tanque está conectado ea garrafa de água, que é usado para balanceamento de umidade, é preenchido com água. </li><li> Encontrar uma dendrite transfectadas maduros com o objetivo × 100 (αplan Apochromat-100 × / 1,46 óleo). Se as células transfectadas no prato são pesquisa, escasso para uma célula desejada com o 40 × objetivo (plano-Neofluar 40 × / 1.3 de petróleo), e depois mudar para o 100 × objetivo de capturar imagens. </li><li> Use 5 × zoom óptico e uma resolução de 256 × 256 pixels para a imagem de um pequeno pedaço de dendrite com espinhas várias. Para capturar as imagens, use a velocidade nominal 9 (pixel tempo de permanência 3,15 ms), que leva 0,5 segundo para terminar um scan. O pinhole é definida como 2μm para a obtenção de fluorescência forte. Ao tirar as imagens, tente usar laser de baixa transmissão, por exemplo 1-5%, para evitar a fotodegradação toda a imagem. </li><li> Selecione a coluna de interesse. Em nosso experimento, escolhemos espinhas cogumelo com seus diâmetros coluna cabeça de ~ 1 mícron. </li><li> Para fazer um experimento FRAP, tomar 5 imagens de controle antes de branqueamento, em seguida, água sanitária a espinha de juros de 10 vezes na transmissão do laser nominal de 100% [A potência do laser de argônio é de 30 mW, com 50% (15 mW) na linha de laser de 488, e mW aproximadamente 3-4 chega ao microscópio através da linha de laser de 488], e então capturar uma série de imagens imediatamente após o clareamento. Para este experimento, as imagens são capturadas a cada 1 segundo durante 15 segundos após o clareamento. O intervalo de tempo deve ser ajustado de acordo com diferentes proteínas alvo e diferentes desenhos experimentais (Fig. 1). </li><li> Guardar as imagens. </li></ol> 3. Análise de dados <ol><li> Abrir imagens com ImageJ software. </li><li> Alinhe a pilha de imagens utilizando a ferramenta align (&quot;pilhas - embaralhando &#39;plugins&#39; → →&quot; align fatias na pilha de &#39;corpo rígido &quot;&quot; tradução &quot;e / ou →) no ImageJ, de modo que a coluna de interesse não flutua , em outras palavras - ele permanece na mesma posição na imagem. </li><li> Medir a intensidade de fluorescência relativa da coluna de interesse (F s), uma região transfectadas mas crus (controle), e uma região de fundo (F b) em imagens de lapso de tempo, usando a ferramenta &#39;Intensidade v Time Monitor &quot;do ImageJ (&quot; plugins &#39;→&#39; stacks - embaralhando &#39;→&#39; Intensidade Tempo v Monitor &#39;). A região de controle poderia ser um pedaço de bem focada dendrite distal. A região de fundo é uma região não-fluorescente. </li><li> Calcular a taxa de fotodegradação (r), comparando a fluorescência da região controle antes (F c0) e depois (F c) fotobranqueamento. r = F c / F c0. </li><li> Normalizar a intensidade de fluorescência da coluna de destino (F) como segue: F = (F s - F b) / r. </li><li> A curva é adequada a intensidade de fluorescência da coluna de destino com uma equação de uma fase exponencial de Graphpad software Prism (Fig. 2) ou outrr software similar. </li><li> Calcular a fração móvel (f m) e da fração de imóvel (f i) pelas seguintes equações: f m = ∞ F / F 0, onde F ∞ é a intensidade de fluorescência após a recuperação completa, e F 0 é a intensidade de fluorescência antes de fotodegradação. f i = 1 - f m. </li></ol> 4. Resultados representativos: Neste estudo, realizamos um experimento sobre FRAP madura neurônios do hipocampo. Em 18-22 DIV, espinhas de cogumelos já estão formados. Utilizando nosso método, as mudanças dinâmicas da intensidade de fluorescência em uma região pequena, como uma coluna, pode ser gravado. Para analisar o processo de recuperação de fluorescência de EGFP, tomamos 5 imagens como controles antes de branqueamento e, em seguida, uma imagem a cada 1 segundo imediatamente após o clareamento por 15 segundos. A resolução da imagem é suficiente para a análise quantitativa. Os perfis de recuperação de fluorescência de proteínas tag fluorescência são altamente reprodutíveis. Também mostrarei brevemente como para definir as frações móvel e imóvel de uma proteína de fluorescência, usando ImageJ e Graphpad software Prism. O método FRAP e análise mostramos aqui pode ser amplamente utilizado em neurociência, biologia celular e outros estudos. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Medições FRAP de EGFP fluorescência em uma coluna de um neurônio culta do hipocampo. Das setas vermelhas indicam o tempo de fotodegradação. Fotografias representam a mesma área antes (Pré) e em 0, 1, 5, 10, 15 segundos após a fotodegradação. A região da coluna, controle e de fundo são marcadas com as letras S, C e B, respectivamente. Neurônios foram mantidos a 37 ° C durante o experimento. Escala de bar, 1 mícron. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Curvas FRAP de EGFP de fluorescência ao longo de um período de 15 segundos. A linha verde mostra a curva original; a linha vermelha mostra a curva normalizada. Os pontos em curvas mostram a FRAP a cada 1 segundo. As curvas foram ajustadas por uma fase equações exponenciais. A fluorescência média antes fotobranqueamento foi contado como 100%. Neste experimento, a fração móvel (MF) é de 94% e da fração de imóvel (IF) é de 6%.

<ol>
	<li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines.">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li><li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins:+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca(2+)-ATPase+2.">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li><li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion.">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family.">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+analysis+of+binding:+proper+and+fitting.">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

FRAP análise tem sido amplamente utilizada in vivo e in vitro estudos 1-2. Esta técnica utiliza comumente GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Proteína de fusão">proteínas de fusão</a> , embora possa também usar as proteínas de fusão alga vermelha 3. Esta análise é sensível e pode ser usado para caracterizar a mobilidade das proteínas GFP. Para produzir análises FRAP significativa, é importante para evitar a fotodegradação desnecessários antes e durante o experimento FRAP. Há duas maneiras de conseguir isso. Primeiro, o processo para pesquisar e observar o neurônio experimental deve ser rápido. Especialmente, a observação de neurônios com um objetivo 100X por um longo tempo significativamente alvejantes a fluorescência. Segundo, potência do laser e digitalização de alta freqüência, muitas vezes aumentar a possibilidade de fotodegradação. Assim, será necessário calcular a taxa de fotodegradação em uma região de controle e depois normalizar a curva FRAP na região experimental. O método de normalização tem sido descrita no protocolo (veja o passo 3,3-3,5 para detalhes). O passo fotobranqueamento também é crítico para assegurar resultados FRAP bom. Neste experimento, lixívia que a espinha de juros de 10 a 100 vezes a transmissão a laser%. Esta condição é suficiente para branquear a fluorescência de uma coluna para o nível de fundo em uma preparação fixo. Assim, vamos definir a intensidade de fluorescência para o mesmo número como pano de fundo em 0 segundos após a fotodegradação. Dependendo da velocidade da primeira varredura, uma quantidade significativa de recuperação de fluorescência já podem ser detectados quando a proteína de interesse é altamente móvel. Muitas sondas proteína fluorescente têm sido desenvolvidos para estudar a dinâmica de proteínas com FRAP. Uma abordagem complementar é, por exemplo, para usar photoactivatable GFP (PA-GFP), ou variantes photoconvertible. Juntamente com a técnica FRAP, essas ferramentas estão se tornando indispensável para estudo de células vivas de imagem 4-6.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>35 mm glass-bottom dishes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek</td>
<td>P35GC-1.0-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>631312</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>6085-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM 710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss TempModule system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graphpad Prism software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Graphpad software</td>
<td>N.A.</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence recovery after photobleaching (frap) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons

FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade das proteínas GFP. Usando um laser de excitação forte, a fluorescência de uma proteína GFP-tagged é branqueada na região de interesse. A fluorescência da região se recupera quando a proteína GFP-tagged crus de fora da região difunde para a região de interesse. A mobilidade da proteína é então analisada através da medição da taxa de recuperação de fluorescência. Esta técnica poderia ser usada para caracterizar a mobilidade de proteína e taxa de rotatividade. Neste estudo, nós expressamos o (proteína verde fluorescente melhorada) vector EGFP em culturas de neurônios do hipocampo. Usando o microscópio confocal Zeiss 710, nós photobleach o sinal de fluorescência da proteína GFP em uma coluna única, e depois tirar fotos lapso de tempo para registrar a recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Finalmente, estimamos a porcentagem de frações móvel e imóvel da GFP em espinhas, analisando os dados de imagem usando ImageJ e softwares Graphpad. Este protocolo FRAP mostra como executar um experimento FRAP básica, bem como a forma de analisar os dados.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade de proteína de fluorescência verde (GFP) marcadas proteínas em células em cultura. Examinamos as frações móveis / imóveis da GFP, analisando o percentual de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Neste estudo, foi realizada na FRAP espinhas de neurônios do hipocampo.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

fluorescence-recovery-after-photobleaching-frap-fluorescence-tagged

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

54.1K visualizações.  National Institutes of Health, Bethesda. FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade de proteína de fluorescência verde (GFP) marcadas proteínas em células em cultura. Examinamos as frações móveis / imóveis da GFP, analisando o percentual de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Neste estudo, foi realizada na FRAP espinhas de neurônios do hipocampo.