Somos gratos a Wellcome Trust e do CEI pelo apoio financeiro. IMGG é um Fellow EMBO. KLH é uma BBSRC financiado pela estudante de doutorado. Agradecemos Philip Rubin e Patrick Tidball de apoio técnico e cultura celular e Andrew Dr Doherty para a manutenção e assistência com os microscópios.

1. Cultura de Células, Transdução Viral, e expressão de proteínas <ol><li> Neurónios do hipocampo de cultura de alta densidade a partir de embrionárias filhotes dia 18 (E18) de ratos sobre lamelas de poli-L-lisina-revestidos de vidro para 14-25 dias in vitro (DIV). </li><li> 6-24h antes para as experiências vivos, as células transduzir com atenuada do vírus Sindbis que contêm a proteína de membrana de interesse, marcado com o pHluorin super-elíptica (SEP). </li><li> Adicionar o meio contendo pseudo-directamente para a lamela contendo 1 ml de meio condicionado e voltou para a incubadora de cultura. O título e tempo para a expressão da proteína após a transdução virai irá variar dependendo do lote de vírus e deve ser determinada para cada lote antes de iniciar as experiências de células vivas. </li></ol> 2. FRAP-FLIP imagens de células vivas <ol><li> Equipamento set-up <ol><li> Transferir a lamela para a câmara de imagem de um microscópio Zeiss Axiovert LSM META 510 confocal.Para minimizar flutuações de energia durante o exame, certifique-se o microscópio foi ligado, com saída do laser de 100%, por pelo menos 20 minutos antes da imagem. </li><li> Imediatamente, substituir o meio de cultura com pré-aquecido (37 ° C) solução de gravação extracelular contendo 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,5 mM de CaCl2, 1,5 mM de MgCl2, 20-25 mM de HEPES (pH ajustado para 7,4 com NaOH) e colocar a câmara sobre a fase de pré-aquecido (37 ° C) do Axiovert Zeiss. Assegurar a osmolaridade da solução de gravação extracelular é ajustada para dentro 10 mOsM do seu meio de cultura. Desde que não evaporação significativa ocorre durante o timecourse do experimento, esta solução 2 CO independente é adequado para experiências curtos (menos de 10 horas). A suplementação com 1-2 mM de bicarbonato de sódio é recomendada. </li></ol></li><li> Definir os parâmetros de captura de imagem <ol><li> Em primeiro lugar, identificar um neurônio expressar a pro recombinantetein de interesse e trazê-lo em foco. </li><li> Com um óleo 63X opôs, adquirir uma imagem de toda a célula utilizando excitação de luz laser em 488nm potência do laser de baixa. Para minimizar a fotodegradação, use uma velocidade nominal (7-9) e pixels de resolução baixa (512-512), mantendo velocidade de digitalização total &lt;1 segundo. </li><li> Selecione uma parte de dendrite de imagem e zoom para capturar um quadro que contém o ROI (~ 1,5-2,5 x zoom óptico). Sempre que possível, assegurar o campo de visão contém vários processos de modo que as medições de dendrites de referência pode ser obtido, para determinar se não específica fotobranqueamento devido à aquisição está a ocorrer. </li><li> Ajuste os filtros, pinhole, velocidade de varredura e ganho de detector de fluorescência para permitir máxima de excitação laser mínima, mas com a saturação limitado. Um diâmetro grande orifício é recomendado, para maximizar a recolha do fotão (2μm é adequado para a coluna e dendritos ternárias). O ganho de detector deve ser suficientemente forte para detectar pequenas incrementos de fluorescência,de tal modo que as imagens muito primeiro lugar, antes da fotobranqueamento não ultrapassar 10% de pixels saturados. </li><li> Guardar esta configuração a ser usado para a pré-/ pós-lixívia e fases de recuperação da experiência. </li><li> Em seguida definem as regiões photobleach; seleccionando um ROI para o photobleach inicial e regiões flanqueadoras para a fase subsequente fotobranqueamento repetitivo. Garantir as regiões flanqueadoras são suficientemente largas para impedir a recuperação por difusão entre as verificações (tipicamente 5 mM, ver fig. 2). </li><li> Ajuste os parâmetros de água sanitária para ambos ROIs photobleach. O photobleach inicial deve ser rápida (0,1-0,5 seg) requerendo entre 1-5 iterações, dependendo do zoom óptico e do volume do ROI. Para as regiões flanqueadoras, a excitação laser deve ser ajustada para assegurar fotobranqueamento contínua das regiões flanqueadoras, mas sem danos fototóxico. </li><li> Como orientação, usamos excitação com laser de 100% para o photobleach inicial, e 10% para o pH repetitivo fotobranqueamentoase. </li></ol></li><li> A aquisição de imagens <ol><li> Uma vez que todos os parâmetros terem sido definidos, a realização do experimento FRAP-FLIP como uma seqüência de imagens de lapso de tempo variável, delineada nos 4 blocos abaixo: BLOCO 1: 3-10 imagens pré-branqueamento de base, a potência do laser de baixa, sem atraso de tempo BLOCO 2: Photobleach o ROI central de potência do laser completa, 1-5 iterações BLOCO 3: 3-10 imagens pós-recuperação de lixívia Bloco 4: photobleach repetitiva de flanqueamento regiões de potência do laser meio com captura de imagem a um intervalo de tempo típico de 1 - 5 segundos, dependendo da taxa de recuperação da proteína sob investigação. </li><li> Finalmente, substituir a solução de gravação extracelular com solução de gravação tamponada a pH 6, contendo 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,5 mM de CaCl2, 1,5 mM de MgCl2, 20-25 mM MES (para extinguir a fluorescência) ou complementado com 50 mM NH4Cl contendo 90 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,8 mM de CaCl2, 0,8 mMMgCl2, 20-25 mM de HEPES, pH 7,4 (para revelar as proteínas em lojas de baixo pH intracelular), (ver fig. 2). </li><li> Recolher pelo menos 10 a 20 conjuntos de dados para cada proteína recombinante, para permitir a análise estatística. Condições para evitar distorcer os resultados, garantir imagem são mantidos consistentes entre repetições. Descarte qualquer conjunto de dados onde incompleta branqueamento, deriva plano focal significativa ou dano celular fototóxica são observados. </li></ol></li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Abra as imagens com o software ImageJ. </li><li> Alinhe as pilhas para explicar pequenas flutuações no plano xy que possam ter ocorrido ao longo da série histórica usando o plugin Stackreg (plugins → → stackreg transformação: corpo rígido → <ok> ). </ok></li><li> Para imagens tomadas em Zeiss confocal, use o plugin Toolbox LSM para relatar os valores de tempo como um arquivo de texto (plugins → LSM Toolbox → Mostrar LSM Toolbox → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),e importar esses valores em uma planilha de análise. </apply></apply></li><li> Para medir as flutuações de fluorescência durante a experiência FRAP-FLIP, dividir o segmento Foto-descoloração em regiões de pixel individuais (aprox. 20pixels) e medir a fluorescência média destes ROIs em cada ponto de tempo (F). Para obter rapidamente esses valores, selecione ROIs múltipla usando a ferramenta ImageJ &quot;ROI Manager &#39;análise (analisar → Ferramentas → ROI Manager) e relatar a fluorescência média por pixel usando o&quot; Plot eixo Z-profile&#39; comando (→ Imagem → Stacks Plot Z eixo do perfil). </li><li> Repetir este passo para medir a intensidade de fluorescência de uma região de fundo, não fluorescente. </li><li> Normalizar a intensidade de fluorescência em cada ponto de tempo subtraindo os valores de fundo para remover o ruído experimental, e todos os valores de dividir pela medida de linha de base média pré-branqueada. </li><li> Medir a intensidade da fluorescência da adjacentes não-Foto-descoloração dendritos para avaliar o nível de não-específicafotodegradação durante a aquisição. Correção para não-específica fotobranqueamento é desencorajado a interpretação de &#39;FRAP-FLIP &quot;de dados e deve ser evitado sempre que possível. </li><li> Para calcular se uma recuperação significativa ocorreu em um ROI, subtrair a média dos últimos medidas 5-10 da seqüência a partir da média das primeiras medidas 5-10 (Af) e determinar a significância estatística. Categorizar o ROIs recuperação e não de recuperar para avaliar o padrão de exocitose (hotspots exocitose ou seja, ou coluna de recuperação do eixo vs). </li></ol> 4. Os resultados representativos O resultado da experiência FRAP FLIP-típica é mostrada na fig. 2. Aqui, um neurónio expressando a subunidade GluA2 de AMPA receptor de glutamato tipo, marcado com setembro foi selectivamente Foto-descoloração ao longo de uma região de dendrite. Fig. 2.A ilustra a região de dendrite que foi trabalhada e indica a ROIs que foram seleccionados para fotobranqueamento (regiões caixa branca). The área branca grande caixa foi branqueada uma vez, seguido pelo repetitivo branqueamento das regiões flanqueadoras em caixa, destacados com duas cabeças setas azuis. A seta indica o vermelho ROI medido, mostrado na ampliação elevada nos painéis inferiores. Fig. 2.B, mostra a intensidade de fluorescência na ROI medido ao longo do tempo da experiência. Neste exemplo, um período de recuperação de um minuto foi registado após a photobleach inicial para permitir que os receptores não branqueado para introduzir o ROI por difusão lateral. Quando as regiões flanqueadoras são Foto-descoloração, o sinal de fluorescência a partir desta fracção altamente móveis de receptores está ocluída a partir da região central, e aqueles dentro da região são diluídos para fora. O aumento na fluorescência (Af) observada ao longo da sequência &#39;FLIP&#39; pode, por conseguinte, ser atribuída à inserção de setembro-GluA2 no eixo dendrítica. A lavagem a pH baixo e pH 7,4 + adição NH4Cl respectivamente confirmar que a fluorescência medida é derivado a partir da superfícieproteínas e revelar a proporção de proteínas intracelulares, sequestrados no interior da ROI medido. Em contraste com FRAP, esta metodologia isola recuperação devido à exocitose, resultando em um nível muito reduzido de recuperação de fluorescência na região Foto-descoloração. Até à data, nenhum modelo matemático fiável tem sido desenvolvido para se ajustar e analisar a recuperação traços de gravado utilizando esta técnica selectiva de branqueamento. É, no entanto, possível encaixar o traço de recuperação com uma recuperação mono exponencial: F (t) = A s - A e 0 (-t / τ) Em que F (t) é a fluorescência no tempo t, A, S é o valor de estado estacionário, um 0 é o deslocamento no tempo 0, τ é a constante de tempo. O crescimento de recuperação é fixada com uma dada taxa de alcançar um equilíbrio, o que corresponde a um estado estacionário entre a inserção e de difusão. Importante, a constante de tempo extraído desta umaNÁLISE não reflecte a constante de tempo de exocitose e só pode ser utilizado para tratamentos comparativos para uma proteína individual. Além disso, o padrão esperado de recuperação de fluorescência é susceptível de ser observado na sub-domínios ao longo da região Foto-descoloração. Análise de ROI pequena dentro de um segmento Foto-descoloração pode ser essencial para revelar exocitose hotspots e é aconselhável para analisar as regiões de comprimentos comparáveis ​​como a variabilidade da densidade destas manchas entre a dendrite irá afectar a taxa calculada. Fig. 3 mostra uma extensão deste protocolo, aplicando o photobleach ao ROI grande secção com dendritos múltiplas no campo de visão, seguido por branqueamento repetitivo selectiva de apenas um dendrite. Esta abordagem permite &quot;FRAP&quot; tradicional e &quot;FRAP-FLIP&quot; dados a serem adquiridas em paralelo. Neste exemplo, neurónios do hipocampo foram infectadas com uma subunidade do receptor de glutamato de a classe de cainato; SEP-etiquetados GluK2. Prior para imagiologia, estes neurónios foram tratados com os cylcohexamide (2hrs em 200μg/ml), para bloquear a síntese de proteínas. Como a recuperação, como a fluorescência no ROIs respectivo medida (Fig. 3.B) revela a proporção de recuperação devido à difusão lateral e reciclagem no dendrito FRAP padrão versus reciclagem sozinho no dendrito submetido ao &quot;FRAP-FLIP&quot; protocolo. Comparando os valores a partir de curvas Af o FRAP versus &#39;FRAP-FLIP &quot;de recuperação, as contribuições relativas de reciclagem (Af rec =% 11.05) versus difusão laterais (Af diff =% 9,35) pode ser inferida. Ao contrário Figura 2, a recuperação não mantém um nível de estado estacionário, mas em vez disso, devido à inibição da síntese de proteínas, mostra um aumento transitório e subsequente queda na sinal, correspondente a depleção do pool de receptor disponível (aproximadamente declínio de 20% observado durante o período de gravação). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Figura 1. Esquemática dos princípios da FRAP vs FRAP-FLIP protocolos Este esquema ilustra os resultados de um protocolo FRAP regulares contra um &quot;FRAP-FLIP&quot;, usando SEP-tag receptores. Recuperação de fluorescência em FRAP tradicional é mostrado na lado esquerdo. Medido de recuperação de fluorescência na ROI central é atribuída a uma combinação de difusão laterais não-f Foto-descoloração receptores SEP-marcados a partir de fora da ROI Foto-descoloração e inserção de receptores por meio de reciclagem e / ou exocitose de novo para o eixo dendrítica. Por outro lado, o Foto-descoloração repetitivo das ROIs acompanhamento ilustrado na lado direito, mostra como &quot;FRAP-FLIP&quot; este protocolo modificado de recuperação silêncios devido à difusão lateral. Como tal, qualquer recuperação fluorescência medida pode ser atribuída a inserção directa no ROI. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Figura 2.A inserção de setembro-GluA2 para a membrana plasmática no eixo dendrítica A) Um neurônio hipocampo expressar SEP-GluA2, seletivamente Foto-descoloração ao longo de uma região de dendrite. O esquema ilustra a região de dendrite que foi fotografada, enquanto que o painel do lado esquerdo superior destaca a ROIs que foram seleccionados para fotobranqueamento. A área branca grande caixa foi branqueada uma vez, seguido pelo repetitivo branqueamento das regiões flanqueadoras em caixa, destacados com duas cabeças setas azuis. Este painel mostra a dendrite antes de fotodegradação. A seta indica o vermelho ROI medido, mostrado na ampliação elevada nos painéis inferiores. B) mostra a intensidade de fluorescência na ROI medido ao longo do tempo da experiência, traçada como o nível de cinzento na ROI (não normalizada). A seta preta realçar o instante do photobleach inicial e seta verde indica o início do fotobranqueamento repetitivo. Af indica thaumento na fluorescência e observado ao longo do período de recuperação, devido à inserção de setembro-GluA2 no eixo dendrítica. PH baixo subsequente e pH 7,4 + NH4 lavagens Cl confirmar que a fluorescência recuperado relaciona-se com tona receptores expressos. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Figura 3. Reciclagem e Reciclagem vs laterais difusão do SEP-GluK2 no eixo dendrítica após o tratamento ciclohexamida A) Um neurônio hipocampo expressar SEP-GluK2, seletivamente Foto-descoloração com FRAP paralelo e protocolos &quot;FRAP-FLIP&quot; de recuperação realizadas ao longo ROIs dendrítica separado. Este foi sujeito a neurónio pré-tratamento com ciclohexamida, para bloquear a síntese de proteínas (2 horas a 200 ug / ml). O esquema ilustra a região de dendrite que foi fotografada, enquanto que o painel do lado esquerdo destacando a ROIs que foram seleccionados para fotobranqueamento. The área branca grande encaixotado foi branqueada uma vez, seguido por repetitiva de branqueamento das regiões flanqueadoras encaixotadas, da parte inferior da dendrite apenas, em destaque com duas pontas setas azuis. Este painel mostra os dendritos antes de fotodegradação. As setas vermelhas destacar o ROIs mostrado em alta ampliação em B) ilustrando a recuperação de fluorescência em FRAP tradicional versus o protocolo &quot;FRAP-FLIP&quot;. Comparações de níveis de intensidade de fluorescência na fase tardia da recuperação (painéis terceiros) mostram a contribuição da difusão lateral e reciclagem contra a reciclagem sozinho. C) mostra a intensidade de fluorescência na ROIs medido ao longo do tempo da experiência, representados como intensidade normalizada valores. A seta preta realçar o instante do photobleach inicial e seta verde indica o início do fotobranqueamento repetitivo. Af rec indica a recuperação transitória devido à reciclagem receptor, determinado a partir do dendrito FRAP / FLIP enquanto Afdiff mede a contribuição da difusão lateral do SEP-GluK2 no eixo dendrítica no &#39;FRAP apenas &quot;ROI. O aumento transiente é seguido por um declínio gradual no sinal, correspondente ao funcionamento para baixo de receptores disponíveis como resultado do tratamento ciclohexamida. O pH baixo e subsequente pH 7,4 + NH4 lavagens Cl confirmar que a fluorescência recuperado relaciona-se com tona receptores expressos.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma estratégia inovadora para visualizar os componentes do plasma tráfico proteína de membrana. A abordagem combinatória de fotodegradação técnicas com a proteína SEP-tag permite seletivamente eventos de inserção da membrana plasmática para ser avaliado. Continuamente fotobranqueamento as proteínas da membrana em regiões acompanhamento durante a recuperação, o método &#39;FRAP-FLIP &quot;avalia a contribuição do tráfico vesicular para a recuperação de fluorescência. Esta nova abordagem permite a gravação directa de inserção de proteína de membrana, permitindo que tanto o número de sub-compartimentos em que a recuperação é observado e da amplitude da recuperação (Af), no estado estacionário a ser determinado. Além disso, a comparação de FRAP com e sem FLIP permite a proporção de recuperação atribuível a difusão lateral de ser calculados. Além disso, na mesma experiência, as regiões de não-Foto-descoloração dendrite adjacente às regiões flanqueadoras Foto-descoloração pode seravaliados qualitativamente durante a recuperação, a perda de fluorescência observada nestas regiões será devido à difusão lateral dos receptores Foto-descoloração para esses segmentos não-Foto-descoloração do dendrito. Este protocolo selectiva fotobranqueamento pode ser utilizada para investigar uma variedade de processos celulares, tais como o tráfico caracterizando excocytosis na membrana plasmática em subáreas definidos (por exemplo, dendritos ou espinhas) FRAP ou avaliar a contribuição da inserção lateral, difusão através da realização de vs FRAP paralelo e &#39; protocolos-FLIP &#39;ao longo dendritos adjacentes (Fig. 3). É evidente que, embora as orientações específicas foram apresentados, cada laboratório será necessário otimizar os parâmetros de imagem de acordo com amostras e equipamentos específicos. Importante, todos os receptores de superfície no ROI precisa ser Foto-descoloração, independente do plano z eixo focal, mas sem danos fototóxico significativa ou não-específica fotobranqueamento. NosERS deve ter cautela ao tentar este protocolo na soma das células, como a elevada percentagem de compartimentos de pH relativamente baixos intracelulares normalmente resulta em fluorescência de fundo de alta nestas regiões. Além disso, enquanto que tenhamos demonstrado como esta técnica pode ser aplicada em varia maneiras, antes de iniciar selectivos experiências fotobranqueamento sobre um novo SEP-etiquetados construir, aconselha que uma caracterização inicial dos receptores marcados é primeiro conduzido, tal como descrito por Ashby et ai 2. Em geral, este método é uma adaptação potente e versátil do protocolo FRAP padrão, permitindo que os eventos de inserção na membrana de plasma a ser avaliada em tempo real.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nome do reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comments (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm lamínulas</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-lisina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml em tampão de borato de lamelas revestimento</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Médio Neurobasal</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% no chapeamento neuronal e alimentação médio</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; A penicilina estreptomicina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; Médio de 1% no chapeamento neuronal e alimentação</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutamina</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 mm / 0,8 mM no chapeamento / alimentação médio</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Soro de cavalo</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% em meios seletivos neuronais só</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 vetor de clonagem</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Para Sindbis produção de vírus</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META sistema confocal</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imagem J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Software livre acesso. Todos os plugins aqui descritas estão disponíveis em<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"Proteínas de membrana&gt;, como receptores e canais iônicos sofrem tráfico ativo em neurônios, que são altamente polarizada e morfologicamente complexo. Este tráfico direcionado é de fundamental importância para proporcionar, manter ou eliminar as proteínas sinápticas.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-eclíptica pHluorin (SEP) é um derivado sensível ao pH de EGFP, que tem sido extensivamente utilizado para imagens de células vivas de proteínas de membrana de plasma<sup&gt; 1-2</sup&gt;. A um pH baixo, protonação de setembro diminui a absorção de fotões e elimina a emissão de fluorescência. Como os eventos de tráfico mais intracelulares ocorrer em compartimentos com pH baixo, onde setembro de fluorescência é eclipsada, o sinal de fluorescência a partir de SEP-etiquetados proteínas é predominantemente a partir da membrana plasmática, onde o setembro é exposto a um ambiente de pH neutro extracelular. Quando iluminado em setembro de alta intensidade, como qualquer corante fluorescente, é irreversível fotodanificada (Foto-descoloração)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Importante, pois o pH baixo sacia absorção de fótons, apenas a superfície expressa setembro pode ser Foto-descoloração enquanto setembro intracelular é afetado pela iluminação de alta intensidade<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento) de SEP-etiquetados proteínas é uma técnica conveniente e eficiente para a avaliação dinâmica de proteínas na membrana plasmática. Quando as proteínas fluorescentes são etiquetados Foto-descoloração em uma região de interesse (RDI) a recuperação da fluorescência ocorre devido ao movimento de proteínas cruas SEP-etiquetados para a região branqueada. Isto pode ocorrer através de difusão lateral e / ou a partir de exocitose de não-Foto-descoloração receptores fornecido por<em&gt; De novo</em&gt; Síntese ou de reciclagem (ver fig. 1). A fracção de proteína imóvel e móvel pode ser determinada ea mobilidade e cinética da fracção difusível pode ser interrogado em condições basais e estimuladas tais como aplicação de estímulos de activação agonista ou neuronais, tais como NMDA ou aplicação de KCl<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós descrevemos técnicas fotobranqueamento concebidos para seletivamente visualizar a recuperação da fluorescência atribuível a exocitose. Resumidamente, um ROI é Foto-descoloração uma vez como com os protocolos padrão FRAP, seguido, após uma breve recuperação, por repetitivo de branqueamento das regiões flanqueadoras. Este protocolo &quot;FRAP-FLIP&quot;, desenvolvido em nosso laboratório, tem sido usado para caracterizar o tráfico de receptor AMPA em espinhas dendríticas<sup&gt; 10</sup&gt;, E é aplicável a uma ampla gama de estudos de tráfico para avaliar o tráfico intracelular e exocitose.</p

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

82.9K visualizações.  University of Bristol. Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

Vídeo: Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neurociência

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...