Agradecemos a membros do laboratório Meshorer, especialmente Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout e Alva Biran, por comentários críticos e para a resolução de problemas experimentos fotobranqueamento em uma base diária. EM é um H. José e Belle R. Braun Professor de Ciências da Vida e é apoiado pela Fundação Ciência Israel (ISF 943/09), o Ministério da Saúde, Israel (6007) da União Europeia (IRG-206872 e 238176), Israel Cancer Research Foundation, o Internal Applicative Grants de Medicina da Universidade Hebraica e do Instituto de Psicobiologia Israel.

1. Chapeamento as células ES T = 0 hrs Plating MEF <ol><li> Brasão da imagem live 8 bem-μ-Slides (ibidi; Munique, Alemanha) com gelatina ou em copos chambered tampa (Lab-Tek, Rochester, NY) ou em pratos de vidro de fundo de cultura (Mattek; Ashland, MA). Deixe por 50-30 min e aspire a gelatina de distância livre. </li><li> Semente 22.000 MEFs / poço em 250 mL de volume total de DMEM [suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS)]. Permitem que as células a crescer em uma cultura de tecidos incubadora (37 ° C, 5% de CO2). </li></ol> T = 6 horas ES revestimento celular <ol start="3"><li> Aspirar DMEM. </li><li> Semente de cada MEF revestido bem com 15.000 células R1 / poço em 250 mL de volume total de células ES media [suplementado com 10% ESC-grade de soro fetal bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 0,1 mM aminoácidos não essenciais, 0,1 mM β- mercaptoetanol, e 1000 fator de leucemia U / ml inibitória (LIF)], para obter 30% a 50% confluência no dia seguinte. </li></ol> 2. Transfecting as células ES T = 24 hrs Transfecção transiente <ol><li> Substituir a mídia de células ES com 250 mL / poço de mídia celular fresco ES. </li><li> Num tubo de ensaio 1,5 ml estéril, adicionar 100 ml de soro de mídia livre [Opti-MEM (Gibco)], em seguida, adicione 10 mL de trânsito LT1 reagentes de transfecção (Mirus) diretamente para a mídia livre de soro. Mix pipetando suave e incubar em temperatura ambiente por 50-20 min. </li><li> Adicione 1,5 g de DNA de fusão GFP plasmídeo (H1E, H1o ou HP1) ao diluída trânsito LT1 reagente. Mix pipetando suave e incubar à temperatura ambiente por 15-30 min. </li><li> Adicionar 13,5 mL / poço da mistura de transfecção. Agitar o 8-bem-μ Slides para assegurar uma dispersão. Depois de 24 horas substituir a mídia antiga cela ES com 250 mL dos meios de comunicação celular fresco ES. </li></ol> 3. Realizar FRAP e FLIP T = 48-72 hrs <ol><li> O experimento pode ser realizado em qualquer microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) mas desde que em um experimento FRAP / FLIP normal, muitas imagens consecutivas são adquiridos, é recomendado o uso de um microscópio confocal girando do disco, que permite velocidade de aquisição e garante que não amostra indesejada branqueamento ocorrerá após o evento inicial intencional de branqueamento. Aqui, nós recomendamos o uso do sistema de disco giratório Revolução confocal (www.Andor.com), com a cabeça do disco Yokogawa CSU-X spinning. Este sistema tem a capacidade dupla para photobleach usando um módulo Frappa especializada, com um sistema de ponto de leitura, e rapidamente mudar a luz de volta para coletar imagens usando o disco girando. Os três proteínas fluorescentes mais comum usado para fotobranqueamento experimentos são GFP, YFP e Cherry. Se GFP ou YFP são usados, a ~ 488 nm do laser é necessária. Para Cherry, usam um laser ~ 560 nm. Em todos os casos, recomendamos o uso de lasers de estado sólido. Ter um estágio automatizado é útil mas não é obrigatório. Uma vez que as células vivas são gravadas, é imprescindível a utilização de uma câmara ambiental (usamos um de LIS, Suíça), o oxigênio controlar, umidade, CO 2 e temperatura. FRAP é realizada utilizando máxima intensidade do laser, enquanto imagem é feito com a potência do laser mínimo exigido (geralmente na área de 10%, quando o nível de fluorescência é adequada). Observe as células com luz fluorescente do comprimento de onda apropriado e selecione uma célula expressando GFP usando uma lente de imersão 60X de petróleo. Assegurar a distribuição subcelular correta. Ocasionalmente, quando os níveis de expressão são muito altos, a localização da proteína pode &#39;derrame&#39; de outros compartimentos, como o nucléolo. Tais células não deve ser selecionado. </li><li> Agora definir um protocolo de imagem: coletar 3-5 frames antes do fotobranqueamento, então photobleach em eucromatina ou heterocromatina (visto como condensado GFP focos) e coletar 90-120 frames após a photobleach, com intervalos 250-1000 ms: H1E-GFP, 1000 ms, H1o e HP1-GFP, 250 ms (intervalo de tempo muda de acordo com a dinâmica das proteínas, onde as proteínas altamente dinâmicos requerem tempo mais curto intervalo). Normalmente usamos intensidade do laser 8-10% para fotobranqueamento com um pulso de laser de μseconds 20-40 (1-2 iterações), mas esses números podem mudar de acordo com a proteína analisada e os níveis de expressão. Quando fotobranqueamento é apropriado, você deve observar um &quot;buraco negro&quot; em sua fluorescência da GFP. O buraco negro está gradualmente re-cheia de recuperação após fluorescência. Embora o disco giratório pode obter até cerca de 60 imagens por segundo (com boa intensidade de fluorescência e quando o zoom em uma única célula), não recomendamos utilizar o sistema a velocidades tão altas devido à baixa qualidade de imagem e maior potencial de fototoxicidade. </li><li> Para um experimento FLIP, estabeleceu um protocolo de imagem diferente: coletar 3-5 frames antes do branqueamento, em seguida, iniciar repetida de branqueamento no mesmo local durante a coleta de imagens. Para cada sec H1E-GFP, lixívia a cada 5 segundos, para H1o-GFP, bleach 2, e para HP1-GFP lixívia cada 1 seg. Bleach umd coletar imagens repetidamente durante todo o experimento. </li><li> Para uma ou outra técnica, repita o processo em 20-30 células. Para fins estatísticos, repetir a experiência de três vezes ou mais, de preferência em dias diferentes. Em populações homogêneas e configurações corretas, o desvio padrão é geralmente baixa (&lt;5%). Para ambos os FRAP e FLIP, o tamanho ea forma da região branqueada influencia a dinâmica de recuperação e deve permanecer constante dentro de um experimento. Além disso, quando duas células são comparados, protocolos idênticos devem ser utilizados e as células devem ser analisados ​​em seqüência, no mesmo dia em que o poder do laser e outras condições podem variar e pode afetar o resultado do experimento. </li></ol> 4. FRAP e Análise de Dados FLIP <ol><li> Em todos os quadros FRAP coletados, medir a intensidade de fluorescência no ROI (ROI b = área branqueada), a área de fundo (ROI bg), ea área nuclear não-branqueada (ROI nb) como uma função do tempo antes e após o clareamento. Quando a região é insignificante branqueada todo o núcleo pode ser selecionado para fins de normalização. </li><li> Para cada ponto do tempo, normalizar os dados de acordo com a fórmula: (ROI b - ROI bg) / (ROI nb - ROI bg) / (b pbROI - pbROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg), pb denota pré-branqueada. Para a pré-bleach imagens deverá obter um valor de aproximadamente 1. A primeira imagem após a lixívia irá indicar a profundidade Bleach. Subtrair o valor de 1 para o valor real Bleach Profundidade. Repita a operação para cada célula e média 20-30 células de cada experimento. </li><li> Em todos os quadros FLIP coletados, medir a intensidade de fluorescência na área não-branqueada nuclear, ea área de fundo (ROI nb = área não-branqueada, ROI bg de fundo =). Cálculo dos dados FLIP é semelhante a uma curva de FRAP, apenas o ROI analisados ​​(ROI nb) deve ser diferente do que a região real branqueada, que não é utilizado para o cálculo: (ROI nb - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) . Também é possível usar uma célula vizinha (ROI n = célula vizinha) para fins de normalização: (ROI nb - ROI bg) / (ROI n - ROI bg) / (pbROI nb - pbROI bg) / (pbROI n - pbROI bg ). Após coleta de dados, é possível ajustar os dados experimentais para simulação de computador. Isto permite calcular, com uma boa proximidade, a fração móvel, a fração de imóvel e da metade do valor máximo. Nós não vamos discutir os aspectos matemáticos e estatísticos de análises FRAP aqui e remeter o leitor para outras publicações excelente 4-9. A profundidade de água sanitária refere-se à distância (no eixo y) entre o pré-lixívia de sinal (100%) e a primeira imagem depois de lixívia, a fração móvel refere-se à distância (no eixo y) entre a profundidade e lixívia o sinal recuperado quando a cinética atinge um platô, ea fração de imóvel refere-se à distância (no eixo y) entre o sinal recuperado e os pré-lixívia de sinal (100%) (ver Figuras 1B e 2B). Além desta análise, não são bons modelos matemáticos para ajustar os dados. Para um único expoente, a equação  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="Equação" width="80" /> onde t é o tempo, A é ​​a fração móvel, 1-A é a fração imóvel e off k é a constante de dissociação, pode ser usado para ajustar os dados, e uma estimativa direta da taxa fora de ligação (k off) pode ser obtidos, bem como para o parâmetro A, que pode ser usado para calcular a taxa de associação. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A e B mostram curvas representativas FRAP de HP1 (esquerda), H1o (meio) e H1E (direita) em células ES R1. Figura de simplicidade e clareza 1A mostra os dados brutos de uma única célula, antes de qualquer normalização e cálculo. A curva amarela corresponde à região branqueada, a curva de púrpura corresponde à área não-branqueada nuclear (quando a região branqueada é insignificante todo o núcleo pode ser selecionado para fins de normalização), ea linha vermelha corresponde à fluorescência de fundo, que é mínima neste caso. Seta vertical representa o tempo de lixívia. Dados normalizados e em média é mostrado na Figura 1B. Observe a recuperação mais lenta da H1 (azul) em comparação com HP1 (vermelho). Também a variante H1E (azul escuro) é mais lenta do que a variante H1o (azul claro). Frações móvel e imóvel e Profundidade Bleach são indicados para HP1. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A e B mostram curvas representativas FRAP comparando eucromatina (esquerda) com heterocromatina (direita) de HP1 em células ES R1. Da mesma forma a Figura 1, Figura 2A mostra os dados brutos de uma única célula, a curva amarela corresponde à região branqueada, curva roxa corresponde à área não-branqueada nuclear, ea linha vermelha corresponde à fluorescência de fundo. Seta vertical representa o tempo de lixívia. Dados normalizados e em média é mostrado na Figura 2B. Observe a recuperação mais lenta da heterocromatina (vermelho escuro) em comparação com eucromatina (luz vermelha). Frações móvel e imóvel e Profundidade Bleach são indicados para eucromatina. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3.. Um experimento típico FLIP de células ES H1o R1 é mostrado na Figura 3A (cru, não-normalizada de dados) e B (dados normalizados e média). Neste experimento, a curva de púrpura corresponde à área não-branqueada nuclear, a linha verde corresponde a um núcleo da célula vizinha ea linha vermelha corresponde à fluorescência de fundo.

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ao contrário das técnicas mais disponíveis, que envolvem cromatina purificada a partir de populações de células ou células fixas, experimentos FRAP seguir as mudanças na dinâmica de proteínas da cromatina em células vivas. Encontramos dinâmica de proteínas da cromatina para ser um bom indicador para a plasticidade da cromatina. No entanto, porque requer a fusão do gene de interesse com GFP, a adição da tag fluorescentes podem interferir com a função da proteína. Assim, antes de prosseguir com FRAP, a ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Trânsito LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-bem-μ Slides </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) permitem o estudo da dinâmica de proteínas em células vivas, com resolução espacial e temporal bem. Aqui nós descrevemos como executar FRAP e ensaios FLIP de proteínas da cromatina, incluindo H1 e HP1, em tronco embrionárias de camundongos (ES) células. Em um experimento FRAP, as células são transfectadas, seja transitoriamente ou de maneira estável, com uma proteína de interesse em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) e suas derivadas (YFP, PCP, Cherry, etc.) No transfectadas, as células fluorescentes, um feixe de laser intenso focado alvejantes uma região relativamente pequena de interesse (ROI). O comprimento de onda do laser é selecionado de acordo com a proteína fluorescente usada para a fusão. A luz do laser de forma irreversível o sinal alvejantes fluorescentes de moléculas no ROI e, imediatamente após o branqueamento, a recuperação do sinal fluorescente na área branqueada - mediada pela substituição das moléculas branqueada com as moléculas crus - é monitorado usando imagens de lapso de tempo. Gerada curvas de recuperação de fluorescência fornecer informações sobre a mobilidade da proteína. Se as moléculas fluorescentes são imóveis, nenhuma recuperação de fluorescência será observado. Em uma abordagem complementar, perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP), o feixe de laser alvejantes mesmo lugar repetidamente e da intensidade do sinal é medido em outras partes da célula fluorescentes. Experimentos FLIP, portanto, medida de decaimento do sinal, em vez de recuperação de fluorescência e são úteis para determinar a mobilidade de proteínas assim como a proteína vaivém entre compartimentos celulares. Vinculação transitória é uma propriedade comum da cromatina proteínas associadas. Embora a maior fração de cada proteína cromatina é obrigado a cromatina em um dado momento no estado estacionário, a ligação é transitória e proteínas mais cromatina têm uma alta rotatividade de cromatina, com um tempo de residência na ordem de segundos. Estas propriedades são cruciais para a geração de elevada plasticidade no genoma de expressão 1. Experimentos fotobranqueamento são, portanto, particularmente útil para determinar plasticidade cromatina usando GFP fusão versões da cromatina proteínas estruturais, especialmente em células ES, onde a troca dinâmica de proteínas da cromatina (incluindo heterocromatina proteína 1 (HP1), histona H1 linker e histonas core) é maior do que em células diferenciadas 2,3.

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Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem. Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...