1. Fixação da amostra e incorporação de resina <ol><li> Amostras de tecido fresco e as células são fixadas por pelo menos duas horas em paraformaldeído 2% e glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1 M em um pH de 7,4. O tamanho da amostra não deve exceder 0,150 milímetro de espessura para permitir a penetração adequada ou fixador, e não deve ser deixado na correção para mais de 12 horas. </li><li> Colocar as amostras em frascos de cintilação 20ml de vidro e lavá-los três vezes, 5 minutos cada, em tampão cacodilato 0,1 M. </li><li> Mancha com 1,5% (w / v) tetróxido de ósmio ferrocianeto de potássio e 1% (w / v) em tampão cacodilato 0,1 M (0,1 M, pH 7,4) por 30 minutos. </li><li> Mancha com tetróxido de ósmio 1,0% (w / v) em tampão cacodilato 0,1 M por 30 minutos. </li><li> Lave uma vez com água destilada duas vezes por 3 minutos. </li><li> Mancha com 1% (w / v) acetato de uranila em água destilada duas vezes por 30 minutos. </li><li> Enxágüe seções por 5 minutos em água destilada duas vezes, e depois desidratar em série de álcool graduada, 2 minutos cada mudança (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Incorporar em concentrações crescentes de resina Durcupan misturado com etanol, 30 minutos cada mudança, a partir de Durcupan 50% em etanol, seguido por: 70%, 90%, 95%, e depois de 100%. </li><li> Substituir com Durcupan fresca e agitar lentamente por 4 horas. </li><li> Seções lugar, usando palitos cocktail de madeira, em microscópios lâminas de vidro revestidas com agente molde de separação, e colocar em 65 ° C forno por 24 horas. </li></ol> 2. Preparação da amostra para o FIB / SEM <ol start="11"><li> Separar a camada de resina, contendo as amostras, de entre as duas lâminas de microscópio de vidro e lave bem para remover todo o molde separar agente. </li><li> Usando um microscópio de luz transmitida com os objetivos de baixa potência, ou dissecar microscópio com iluminação transmitida, para identificar a região de interesse dentro da fatia de resina. </li><li> Um pequeno corte (3 mm x 3 mm) quadrado ao redor da região de interesse usando uma lâmina de barbear e pau esta para o topo do bloco de resina em branco com cola acrílica (Figura 1). Espere 5 minutos para a cola para endurecer, e então prosseguir com a próxima etapa. </li><li> Prenda o bloco para o titular do ulramicrotome e, usando a lupa em anexo, acabamento ao redor da região de interesse com uma lâmina de barbear até que apenas uma pequena pirâmide de restos de material. </li><li> Ainda cortar o bloco, usando uma faca de vidro fixo no ultramicrótomo, de modo que a região de interesse pode ser precisamente localizado no que diz respeito às dimensões da superfície do bloco (Figura 1). Cortar uma borda do bloco, perto da região de interesse, de modo que um passo perpendicular é cortado através da amostra (Figura 1 e 2). Esta etapa forma o rosto de imagem (Figura 2). </li><li> Remover o bloco do ultramicrótomo e fotografar a região de interesse dentro do bloco, utilizando um microscópio de luz transmitida. </li><li> Corte o bloco cortado longe do topo da resina remanescente. Isso é feito usando viu um joalheiro e garante que apenas um pequeno bloco é colocado dentro do FIB / SEM. A altura total deste bloco não deve ser superior a 5 mm. </li><li> Cola para bloquear a um stub de alumínio com pasta de carbono garantindo que o lado a ser trabalhada é na parte mais externa (Figura 1). </li><li> Depois que a cola secar, o revestimento do bloco com uma fina camada de ouro (&gt; 20 nm; Cressington sistema de evaporação a vácuo). </li></ol> 3. Imagem na FIB / SEM <ol start="20"><li> Com uma ampliação baixo, e utilizando elétrons secundários de imagem (5 kV, 0,5 NAMP), orientar o bloco de modo que a região de interesse escolhida eo lado do bloco a ser trabalhada é de frente para o operador (Figura 2 c, d). </li><li> Orientar o bloco de modo que a face a ser trabalhada fica paralela ao feixe de moagem. Isto significa que feixe de elétrons é orientado a 54 ° a esta face (Figura 2 b). </li><li> Usando um feixe de íons atual de 13-27 NAMPS em 30 kV remover uma faixa estreita de resina a partir da frente da região a ser trabalhada. </li><li> Alternar para o modo de imagem retroespalhados para ver a cara moída que recobre a região de interesse. </li><li> Usando a imagem de referência luz microscopia (tomada no passo 16) ea imagem da face moída localizar a região exata no bloco a ser moído e fotografada (Figura 2). </li><li> Depositar uma camada protetora (aproximadamente 1 mícron de espessura) de carbono (ou metal), utilizando o sistema de injeção de gás do microscópio, sobre a superfície do bloco, acima da região de interesse (Figura 2). </li><li> Usando uma corrente de 700 picoAmps, moinho finamente a região do bloco no qual as imagens finais serão tomadas. </li><li> Deixe o feixe de moagem moinho completamente este rosto imagem até sem artefatos moagem pode ser visto no rosto. A fábrica completa da face é verificado observando alterações em cada imagem subseqüente em todo o campo de visão. Moagem inadequada pode também visto como listras brancas ou &quot;cortinas&quot; aparecendo vertically na imagem. </li><li> Deixe o microscópio para, pelo menos, duas horas para todas as mudanças térmicas a se dissipar. Isso reduz o risco de que o bloco irá enfrentar drift durante o exame, resultando em imagens desalinhados. </li><li> Selecionar os parâmetros para geração de imagens de microscópio do rosto em série. Garantir que o feixe de elétrons tem uma tensão que é baixo o suficiente para a imagem apenas uma profundidade muito superficial de material em face bloco. Isso também deve ser muito mais rasa do que a espessura da face para ser removido. Parâmetros típicos para geração de imagens são tensões entre 1,2-2,0 kV, com tamanhos de pixel entre 4-20 nm. O pixel habitar precisa de tempo para ser mantido em torno de 10 μsecs de modo que o tempo total para moer o rosto e adquirir uma imagem é mantido abaixo dos 2 minutos (Figura 3). </li></ol> 4. Segredos para o sucesso Passo 1) Verifique as amostras não são mais espessas do que 150 mícrons. Isto irá permitir uma penetração adequada das manchas diferentes e resina para o material. Isto pode ser conseguido pela secção das amostras com uma vibratome imediatamente após a fixação. Esta espessura é apropriado para o tecido cerebral. Outros tecidos precisam ser testados para garantir a fixação adequada e coloração. Etapa 3) As amostras devem ser distribuído gratuitamente em toda a solução, e não se agrupou em uma parte do frasco enquanto este fixador secundário é introduzido. Isto irá assegurar a máxima penetração da amostra e reduzir a amostra se tornar distorcidas durante esse processo de fixação. Isto é conseguido rodando suavemente as amostras dentro do frasco imediatamente após a solução é adicionada. Passo 15) Certifique-se que a região de interesse está localizado imediatamente abaixo (&lt;30 microns) a superfície do bloco. Isto irá reduzir a quantidade de moagem pelo feixe de íons durante a fase de aquisição de imagem. Passo 22) O tempo de varredura do feixe de íons precisa ser adequa-da para garantir que o rosto de imagem inteiro é completamente moído. Moagem inadequada será mostrado como listras brancas, ou &quot;cortinas&quot; que aparece verticalmente para baixo o rosto de imagem. Passo 26) A face final, moído deve ser maior do que o cara que é imaginada. Isto é porque a resina moída é ejetado do bloco e redeposita na superfície do bloco nas imediações. Este redeposição pode interferir no campo de imagem de vista e é evitada por moagem uma área muito grande do que é imaginado. Para uma janela de imagem que é de 20 mícrons de largura, a face moída bloco é maior do que 30 microns de largura. Passo 29) É fundamental que os parâmetros de feixe de elétrons são tais que a imagem é gerada por elétrons que emergem apenas os primeiros poucos nanômetros da superfície do bloco. Este um acheved, minimizando a tensão a menos de 2 kV e garantindo que nenhum elétrons penetrar muito longe. Este é também ajudou usando uma tensão de rede no detector de modo que apenas o elétron com maior energia contribuem para a imagem final. Normalmente, uma tensão de 1,3 kV grade é usada para uma tensão de 1,5 kV imagem. 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Preparação de bloco de resina. Resina) incorporado secção coronal (80 mícrons de espessura) através de um cérebro de rato adulto visto em um steromicroscope. A imagem mostra claramente a diferentes regiões do cérebro que pode ser cortado a partir da seção (b), utilizando uma lâmina de bisturi. Aqui, um quadrado de 1 mm a partir do córtex é removido e (c) preso a um bloco de resina em branco. D) O bloco de resina é então cortada com uma faca de vidro montada em um ultramicrótomo, e uma vez que o bloco foi reduzido para apenas deixar o região de interesse (e), um passo é cortar perpendicular à superfície frontal do material incorporado. f) Toda esta região cortada é então cortada do resto da resina e montados em um topo de alumínio prontas para o revestimento de metal e de imagem no microscópio eletrônico de varredura. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Preparação do bloco para enfrentar FIB / SEM imagem. A) e b) mostram ilustrações do bloco e da borda que é moído para criar o rosto de imagem (indicado com a seta de duas pontas pretas). A posição do feixe de íons (branco) é mostrada paralelamente à face de imagem, eo feixe de elétrons (cinza) é mostrado batendo o rosto a 54 ° para o feixe de íons. C) mostra uma vista do bloco de tomadas com o feixe de elétrons e fotografada com os elétrons secundários. Ao longo deste lado do bloco de uma região escura (indicado com caixa branca pontilhada) mostra uma parte do rosto que foi mais ou menos moído (mostrado com duas cabeçased seta preta) para revelar a amostra subjacente. d) Quando esta região é fotografada usando apenas os elétrons retroespalhados o tecido incorporado pode ser visto. Aqui, a largura total da secção de tecido incorporado é indicado com uma seta dupla cabeça branca. Barra de escala em c) é de 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Imagens do um volume de tecido do cérebro com voxels isotrópicos. A) Invertida imagem contraste retroespalhados da face de blocos mostrando a ultra-estrutura dentro de uma região do cérebro do rato. Todas as membranas são visíveis, bem como estruturas macromoleculares grande. B) Um total de 1.600 imagens foram coletadas em cinco espaçamentos nm, resultando em uma pilha de imagens com voxels isotrópicos. C) Essa pilha pode ser trabalhada em qualquer plano com a mesma resolução. Esta imagem mostra conexão sináptica única que é imaginada no plano xy eo plano yz.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica da FIB / SEM funciona perfeitamente quando a região de interesse não é muito grande. O limite superior para um volume imaged depende do feixe de íons e da área que pode consistentemente moinho repetidamente durante muitas horas. Até agora isso tem sido feito com áreas de cerca de 60 x 60 microns, no entanto, imaging toda esta área não é possível com uma resolução de imagem adequada, principalmente devido ao fator tempo na coleta de uma imagem tão grande. Como exemplo, a 4 imagem kx 4 k com um pixel tempo de permanência de 10 microssegundos levaria 2 minutos e 40 segundos para adquirir, e para um campo de visão de 60 microns isso só dar um tamanho de pixel de 15 nm. Para geração de imagens da ultra-estrutura das células e tecidos, um tamanho de pixel menor é mais adequado, geralmente entre 4 e 10 nm / pixel. Para uma área de 60 x 60 microns a imagem seria adquirido em 10 horas, mesmo se o microscópio tinha essa capacidade. Por estas razões, o microscópio é uma ferramenta ideal para volumes de imagem na ordem de 10 x 10 x 10 microns, ou regiões significativas de células inteiras. Isso pode facilmente ser feito dentro de um período de 48 horas em amostras que são bem contrastadas com este procedimento. Até agora, o protocolo tem sido usado principalmente com o tecido cerebral, bem como vários tipos de culturas de células de mamíferos aderir em lamínulas. No entanto, o procedimento de fixação e coloração pode ser usado com muitos outros tipos de material biológico, incluindo material de planta para produzir igualmente pilhas de imagens bem contrastadas. Portanto, a principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de volumes imagem com voxels isotrópicos. Pilhas de imagens deste tipo permitem a análise do volume 3D usando imagens feitas em qualquer avião na pilha. A vantagem disto é permitir que o observador a características de imagem na série de imagens de qualquer direção e proporcionando um maior detalhe de imagem (Figura 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Cola de cianoacrilato </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan resina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscópio (Zeiss, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Slides de vidro histologia </td><td> Menzel-Glaser, Alemanha </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Fabricante de vidro faca: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Cintilação de vidro frascos (20ml) </td><td> EMS, EUA </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldeído </td><td> EMS, EUA </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Viu joalheiro </td><td> EMS, EUA </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Agente Mould separando </td><td> Glorex, Suíça </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Tetróxido de ósmio </td><td> EMS, EUA </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> EMS, EUA </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sais de fosfato de tampão fosfato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td> 71642 e 71496 </td></tr><tr><td> Cacodilato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater com o objectivo de ouro </td><td> Cressington, EUA </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrótomo: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranila </td><td> EMS, EUA </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Este protocolo descreve como de amostras biológicas, como o tecido cerebral, pode ser trabalhada em três dimensões usando o microscópio de íon focado feixe de elétrons / digitalização (FIB / SEM). As amostras são fixadas com aldeídos manchado metal, heavy utilizando tetróxido de ósmio e acetato de uranila. Em seguida, são desidratados com álcool e infiltradas com a resina, que é então endurecido. Usando um microscópio de luz e ultramicrótomo com navalhas de vidro, um pequeno bloco contendo os juros região próxima à superfície é feita. O bloco é então colocado dentro da FIB / SEM, eo feixe de íons usados ​​para cerca de um moinho de face vertical de um lado da quadra, próximo a esta região. Utilizando elétrons retroespalhados para a imagem das estruturas subjacentes, um pequeno rosto é, então, moída com um fino feixe de íons ea superfície examinado mais de perto para determinar a área exata da face a ser trabalhada e moído. Os parâmetros do microscópio são, então, definido de modo que o rosto é repetidamente moído e fotografada para que as imagens em série são coletados através de um volume do bloco. A pilha de imagem normalmente contêm voxels isotrópicos com dimensões como nm uma pequena 4 em cada direção. Esta qualidade de imagem em qualquer plano de imagem permite ao usuário analisar ultra-estrutura celular em qualquer ângulo de visão dentro da pilha de imagens.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Este protocolo descreve como resina de tecido cerebral incorporado pode ser preparada e fotografada nas três dimensões do feixe de íons focalizado, microscópio eletrônico de varredura.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K visualizações.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Este protocolo descreve como resina de tecido cerebral incorporado pode ser preparada e fotografada nas três dimensões do feixe de íons focalizado, microscópio eletrônico de varredura.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...