Agradecemos a Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard para o uso de uma bomba peristáltica e vibratome, bem como Karen L. Bentley e Gayle Schneider no Electron Microscope Facility Núcleo de Pesquisa da Universidade de Rochester Medical Center para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (EY019277), Fundação Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, e Alfred P. Sloan Foundation para AKM. M.-È.T. é financiado por um de Fonds la recherche en santé du Québec (FRSQ) prêmio de treinamento pós-doutorado.

1. Perfusão animais <ol><li> No dia antes da perfusão, prepare: - 2 L de tampão fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) e 1 L de sódio tampão fosfato (PBS, 0,9% NaCl em 50 mM PB, pH 7,4) em água destilada duas vezes. Armazenar o PBS e 1L de PB a 4 ° C. Estes serão usados ​​para a perfusão e incorporação de pré-imunocitoquímica. - Solução de 1L de paraformaldeído 4,0% (PFA, pH 7,4) fixador, o que permitirá a perfusão de 6 camundongos. Para o efeito, aquecer 1 L de PB sob uma coifa. Pesar 40 g de paraformaldeído granular (PFA) e despeje na solução PB quando atinge 60 ° C. Quando a solução é clara, com o PFA completamente dissolvido, arrefecer à temperatura ambiente (RT) e armazenar a 4 ° C. </li><li> No dia da perfusão, preparar 500 mL de solução de acroleína 3,5% em PB sob uma coifa. Então, filtrar a acroleína 3,5% e 4,0% PFA soluções utilizando papel de filtro. </li><li> Para anestesia mouse, injetar pentobarbital sódico (80 mg / kg) para o peritônio com uma calibre 27 ½ &quot;agulha. </li><li> Durante a perfusão, 50 mL de PBS, 75 ml de acroleína, e 150 mL de PFA serão seqüencialmente passam para a circulação mouse. Para configurar a bomba peristáltica, encha o tubo com PBS e fixar um calibre 23 ¾ &quot;agulha borboleta em uma extremidade. Mergulhe a outra extremidade do tubo na solução de perfusão (PBS, acroleína ou PFA). Definir a velocidade da peristáltica bomba para 20-25 mL / min para os ratos jovens e adultos. Durante a perfusão, evitar cuidadosamente as bolhas de ar que formam na tubulação. </li><li> Espere até que o rato anestesiado não responde mais a estímulos dolorosos, como uma pitada de cauda, ​​antes de prosseguir. Coloque o animal em uma bandeja de dissecação e corrigir as patas com fita. Com uma pinça e tesouras, abrir a pele e cavidade torácica para expor o coração. Para minimizar a isquemia cerebral, a perfusão deve ser iniciada rapidamente. Corte aberto o átrio direito com uma tesoura pequena e iniciar a bomba peristáltica. Enquanto mantém o coração com uma pinça, insira a agulha borboleta no ápice do ventrículo esquerdo. </li><li> Ao mudar solução, parar a bomba peristáltica, a transferência da tubulação de uma solução para outra, e reiniciar a bomba imediatamente. </li><li> Quando 150 mL de PFA passou, parar a bomba peristáltica. Com uma tesoura pequena, corte a cabeça, abrir a pele e quebrar o crânio entre os olhos. Usando uma pinça pequena, com cuidado pegue pequenos pedaços de crânio até o cérebro pode ser facilmente removido. Pós-fix o cérebro por 2 horas a 4 ° C em PFA. Lavar 3 vezes 10 minutos em PBS. </li><li> Imediatamente cortar o cérebro em transversal (50 seções mm de espessura) em ice-cooled PBS usando um vibratome. Com um pincel fino, a transferência de seções selecionadas para imunocitoquímica em um frasco de vidro contendo PBS. Armazenar os restantes secções a -20 ° C em crioprotetor (30% de etileno glicol e glicerol 30% em PBS) por até vários anos. </li></ol> 2. Pré-incorporação imunocitoquímica <ol><li> Para imunocitoquímica, as seções são processados ​​livremente flutuando em frascos de vidro. Durante todo o processo, é preciso evitar cuidadosamente deixando seções secar. </li><li> Primeiro, remova a PBS usando uma pipeta de transferência e substituir imediatamente com uma nova solução de borohidreto de sódio a 0,1% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos, retirando todas as bolhas, e incubar por 2 horas em temperatura ambiente em uma solução de bloqueio de PBS contendo 0,5% de gelatina e 5% de soro normal do animal em que o anticorpo secundário foi gerado (soro de cabra normal em presente exemplo da imunocoloração por Iba1). </li><li> Incubar durante 48 horas com o anticorpo primário em solução de bloqueio. Para Iba1 imunomarcação, utilize o anticorpo de coelho anti-Iba1 (1:1000). </li><li> Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos e incubar em anticorpo secundário conjugado com biotina (1:1000) em solução de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. Para Iba1 imunocoloração, use cabra anti-coelho IgGs. </li><li> Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos e incubar em estreptavidina-peroxidase (1:1000) em solução de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe seções com PBS 10 minutos e com Tris / HCl-buffered saline (TBS, 50 mM, pH 7,4) duas vezes 10 minutos. Para revelar a rotulagem, incubar seções com DAB 0,05% e peróxido de hidrogênio 0,01% em TBS (solução recentemente preparada). Quando a coloração é marrom-escuro (veja o exemplo na Figura 1), parar a reação por lavagem em TBS. Em qualquer caso, a reação final após um máximo de 5 minutos. Enxágüe seções com TBS 10 minutos e com PB 2 vezes de 10 minutos. </li></ol> 3. Processamento para microscopia eletrônica <ol><li> Transferência de seções em PB em uma placa de cultura com vários poços usando um pincel fino. Prepare a solução de tetróxido de ósmio 1% em PB sob um capuz fumegante. Remover PB dos poços da placa de cultura e<html> difundir as seções planas com um pincel fino. Seções mergulhadas imediatamente em ósmio 1% por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Transferir as seções em frascos de vidro, lave com PB 3 vezes 10 minutos, e desidratar até 2 minutos para imersões ascendente concentrações de etanol: 2 vezes 35%, 1 vez cada um dos 50%, 70%, 80%, 90%, e 95 %, 3 vezes 100%, seguido por três vezes óxido de propileno. </li><li> Para preparar a resina Durcupan, combine 20 g do componente A, 20 g do componente B, 0,6 g do componente C e 0,4 g do componente D em um copo descartável, misture bem até que a cor se torna uniforme, e despeje em uma lata de alumínio pesam prato. Se necessário, blocos de resina podem ser preparados por vazamento de resina em moldes de incorporação e cura em um forno de 55 ° C durante 48-72 horas. </li><li> Usando um pincel fino lavado com óxido de propileno, remova as seções do óxido de propileno e mergulhe na resina Durcupan para impregnação durante a noite a RT. </li><li> No dia seguinte, coloque o prato de alumínio pesam em um forno de 55 ° C por 10 minutos para amolecer a resina. Usando uma escova lavados com óxido de propileno, um filme de revestimento incorporando Aclar com uma fina camada de resina, estabelecer as seções, cubra com outro filme de incorporação, e distribuir pesos leves (cerca de 2 g, por exemplo as tampas de plástico de frascos de vidro) em cima para ajudar a espalhar a resina. Para polimerização da resina, incubar no forno por 48-72 horas (a 55 ° C). </li><li> Após a polimerização, remover os pesos leves e incorporação de filme no topo das seções. Sob um microscópio binocular, selecionar áreas de interesse quadrados (cerca de milímetro 2x2) e com cuidado especial sobre o consumo-los do filme usando uma lâmina de barbear. </li><li> Cole as áreas de interesse na ponta de blocos de resina usando Superglue e cura no forno 55 ° C por 1 hora. </li><li> Em preparação para corte, cortar o bloco de resina com a forma de um trapézio isósceles com uma lâmina de barbear. </li><li> Utilizando um ultramicrótomo e uma faca de vidro, remover a cola e resina na superfície do tecido. Preencha o barco da faca de vidro com água bidestilada e cortar alguns semi-finos (0,5-1 mm de espessura). </li><li> Transferir as seções para um slide SuperFrost com um laço perfeito. Seca das seções, colocando o slide em uma placa de aquecimento a 80 ° C por 1 minuto. Cubra com algumas gotas de 0,1% mancha azul de toluidina (2 g de borato de sódio e 0,2 g azul de toluidina em 200 mL de água bidestilada) por 1 minuto. Lavar o excesso de corante com água destilada duas vezes. Exame das seções com um microscópio de luz permitirá distinguir o tecido manchado a partir da resina (Figura 2). </li><li> Retomar o corte até a fronteira entre o tecido e resina alcança o meio das seções. Note que o procedimento a seguir exige treinamento. Substituir a faca de vidro com uma faca de diamante e preencha o barco com água destilada duas vezes. Prata para cortar seções prata-ouro ultrafinos (60-80 nm de espessura) e cuidadosamente coletá-los em grades de cobre de malha fina usando uma pinça invertida. Seca das grades em um papel de filtro. </li><li> Para melhorar o contraste, as seções ultrafinas podem ser marcadas com citrato de chumbo (0,03 g citrato de chumbo e 0,1 mL de hidróxido de sódio 10N em 10 mL de água bidestilada 1). Usando uma pinça fina invertida, a transferência de uma grade para uma gota de citrato de chumbo por 2 minutos. Retire a grelha e delicadamente enxágüe em três banhos sucessivos de água destilada duas vezes. Por fim, seque as grades de um filtro de papel e guarde-os em uma caixa de grade, até o exame microscópico de elétrons (Figuras 3-6). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iba1 manchada de secção no nível de luz microscópica. A distribuição celular de Iba1 é restrito a microglia, que mostra a especificidade da imunomarcação. Barra de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Toluidina azul manchado de seção semi-fina no nível de luz microscópica. Nota da fronteira entre o tecido e resina onde a imunomarcação aparecerá mais intensa no microscópio eletrônico. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ultrafinos seção mostrando Iba1-imunopositivas pericário microglial e processos ao nível da microscopia eletrônica. Iba1 positivo elementos estruturais são reconhecidos por sua imunoperoxidase-DAB precipitar elétron-denso. Barra de escala = 2 m. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ultrafinos seção exibindo Iba1-imunopositivas processos microglial de tamanhos e formas diferentes ao nível da microscopia eletrônica. Barra de escala = 2 m. e 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ultrafinos secção que mostra a maior ampliação de um processo Iba1 positivo microglial na Figura 4, permitindo a identificação de suas organelas intracelulares. Barra de escala = 1 mícron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Secção ultrafinos revelando a maior ampliação das relações entre um processo ultra-Iba1 positivo microglial e elementos próximos de neuropil incluindo sinapses. Barra de escala = 1 Hm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato para imunomicroscopia que oferece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal, quando os procedimentos são rigorosamente executado. Combinado com o TEM, este método permite distinguir elementos celulares com poucas características e critérios de identificação. Em particular, a coloração de imunoperoxidase DAB-de Iba1 permite identificar perikarya m...

* Deve-se sempre trabalhar sob um exaustor e usar luvas ao manusear nitrilo acroleína, paraformaldeído, e ósmio e também deve dispor de seus resíduos de forma adequada.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é extremamente útil para visualizar microglial, oligodendrocytic, astrocíticos e neuronal compartimentos subcelulares (dendrito, espinha dendrítica, axônio, axônio terminal, pericário), bem como suas organelas e do citoesqueleto intracelular no sistema nervoso central em alta resolução espacial. Combinado com o TEM, pré-incorporação imunocitoquímica permite a discriminação de elementos celulares com poucas características e critérios de identificação (por exemplo, microglial perikarya e processos, quando se utiliza um anticorpo contra o marcador microglia específicos Iba1 (cálcio ionizado molécula adaptador de ligação 1; como apresentado aqui)), identificando o conteúdo do neurotransmissor dos elementos celulares (por exemplo, serotoninérgicos) e sua localização ultra-estrutural de proteínas solúveis ou ligada à membrana (por exemplo, 5 HT1A e EphA4 receptores). Aqui, nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de camundongos com acroleína fixador, remoção e corte do cérebro, bem como imunoperoxidase diaminobenzidina-coloração (DAB), a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame com TEM. Quando rigorosamente realizada, esta técnica fornece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K visualizações.  University of Rochester. Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Neurociência

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Microscopia de fluorescência de três fótons profundos em rato intacto e cérebro de zebrafish

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imagem de cálcio de dois fótons e campo amplo no colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor em destaque: Revelando a codificação neural e os mecanismos de processamento visual no colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...