This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol>
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As avaliações das propriedades contrácteis do músculo esquelético fibras individuais permeabilizadas são utilizados para investigar a função muscular de uma grande variedade de contextos. Exemplos incluem estudos que avaliaram os efeitos do envelhecimento 12, exercício 10,13,14, 15, voo espacial lesão 2,3,16, tratamentos de drogas 17,18, doença e 19 de manipulação genética 20,21 na estrutura e função de fibra. Devido à capacidade de avaliar directamente o desempenho contráctil de miofibrilas na sua configuração nativa, esta técnica fornece uma plataforma a partir da qual atraente para formar uma compreensão da função ausente miofibrilar de efeitos potencialmente confusão que estão presentes quando a transmissão de sinal neuromuscular e a libertação de cálcio induzida por excitação são incluídos no sistema estudado. Além disso, o teste funcional de fibras individuais podem ser usados ​​para complementar os resultados de identificação de proteína contráctil, tais como aquelesobtida por meio de imuno-histoquímica ou electroforese em gel de + 22 Western blot. Uma das funções primárias do músculo esquelético é de gerar força. Consequentemente sF o, uma medida da capacidade de geração de força intrínseca de um sistema contráctil, é de grande interesse para os fisiologistas musculares. Estimativas fiáveis ​​do SF o exigem medidas exatas de ambos CSA fibra e F o. Como as fibras são, em geral, nem circular em secção transversal, nem uniforme no CSA longo do seu comprimento, muito cuidado deve ser tomado ao estimar CSA. Para este fim, as medições são feitas em vários locais ao longo do comprimento da fibra e, em cada local, a partir de duas perspectivas separadas por 90 °. Medidas confiáveis ​​da F o exige atenção a vários detalhes, incluindo respondendo por força passiva, ajustando comprimento do sarcômero para maximizar a sobreposição de filamentos grossos e finos, empregando uma solução de ativação com uma concentração de cálcio tchapéu resulta em activação máxima, mantendo a temperatura experimental desejado, e a manutenção das condições óptimas de armazenagem (temperatura e duração) com as fibras antes do dia da experiência. Embora as etapas descritas aqui descrever o procedimento para avaliar força isométrica máxima, é freqüentemente desejável para avaliar outras qualidades funcionais importantes de fibras musculares esqueléticas. Isto pode ser conseguido através do alargamento do protocolo experimental para incluir manipulações mecânicas adicionais da fibra. Por exemplo, a medição da velocidade a que a fibra encurta contra uma série de diferentes cargas permite a determinação da relação força-velocidade, a partir dos quais as relações de força e de velocidade de alimentação de energia pode ser calculado 10,23,24. Além disso, a velocidade de encurtamento sem carga pode ser determinada através da utilização do &quot;teste de folga&quot; 25, o qual consiste em aplicar uma série de passos de encurtamento de indução de folga e measuring do tempo requerido pela fibra para remover a folga. Outro parâmetro cinética que é freqüentemente relatado é k tr, a constante de velocidade para a força de reconstrução na sequência de uma perturbação mecânica que destaca temporariamente todos pontes cruzadas 26. Por fim, a relação entre a concentração de cálcio e a geração de força activa (a &quot;relação força-PCA&quot;) é muitas vezes de interesse 18 e pode ser determinada por exposição da fibra a uma série de soluções com concentrações que variam de cálcio abaixo do limiar de activação do contráctil sistema para aqueles suficiente para provocar a activação máxima e, portanto, a força máxima (Fo). Embora grande parte do equipamento mencionado é necessária para avaliar a contratilidade de fibra única, outro equipamento não é absolutamente necessário. O controlador de comprimento, por exemplo, é essencial para qualquer protocolo experimental que requer alongamento rápido ou preciso, ou encurtamento da fibra,mas não é absolutamente necessário para a avaliação de força isométrica máxima (apesar de um nível de força de zero no registro vigor ainda deve ser identificado por alguns meios). Os prismas que permitem a observação da fibra a partir do lado, enquanto útil para avaliar a área em corte transversal, não são absolutamente necessárias quando o posicionamento da fibra no interior da câmara experimental. Além disso, meios alternativos para expor a fibra para as várias soluções experimentais poderia ser empregue, incluindo concepção de um sistema de accionamento manual de câmaras ou uma única câmara que permite o enchimento e esvaziamento rápidos de soluções. Finalmente, enquanto que as temperaturas experimentais sub-fisiológicas, tais como 15 ° C são normalmente utilizados para melhorar a reprodutibilidade das medições mecânicas 1,2,3,5,8,12,17,27, é possível gerar dados válidos a outras temperaturas 23 , 28, contanto que os efeitos da temperatura sobre as propriedades de solução (concentração de cálcio, pH, etc.) são tomadas em consideração. </p&gt; As composições das soluções de teste estão entre os aspectos mais críticos das técnicas de fibras permeabilizadas descritos aqui. Considerações sobre a composição da solução são complexas e além do escopo deste artigo. As soluções descritas no Passo 5 da secção de protocolo são concebidos com um ênfase na activação rápida da fibra permeabilizadas sobre a sua transferência desde a pré-activação de activação de soluções, mantendo uma força iónica constante, a composição catiónica, e osmolaridade 6,29. Outras abordagens para a composição da solução têm sido empregados com sucesso notável por outros grupos de pesquisa e normalmente fazem uso de constantes de ligação publicados e ferramentas computacionais 27,30,31. As concentrações de iões cálcio em várias soluções de activação é particularmente importante em estudos que envolvem a activação submáximo, tais como as avaliações força-PCA. Para as experiências em que as fibras são completamente activados, tais como os que descrevemd aqui, a concentração de cálcio na solução de activação, tipicamente excede por uma margem confortável, que requerida para atingir a força máxima, fazendo o seu conhecimento preciso menos crítica. A adição de fosfato de creatina é importante para tamponar os intramyofibrillar ATP e ADP flutuações que de outra forma seriam associadas com a actividade contráctil. A creatina-quinase é necessária para catalisar a transferência de fosfato a partir de fosfato de creatina ao ADP. Sob condições experimentais que resultam em elevadas taxas de turnover ATP, incluindo trabalho a temperaturas elevadas ou a medição de encurtamento de alta velocidade em fibras rápidas 32, creatina quinase deve ser adicionado à solução para completar o endógena de creatina quinase que permanece ligado à fibra. As condições experimentais menos exigentes, o sistema de regeneração de ATP 27 é menos crítica. As limitações da técnica de fibra única permeabilizada incluem o seguinte. Os dados gerados por esses testes de definir opropriedades contrácteis da unidade miofibrilar específico que foi ligado ao dispositivo experimental. Por conseguinte, este capta apenas uma pequena fracção da totalidade da fibra multinucleadas partir do qual o segmento que foi obtido, por sua vez, representa uma pequena fracção do número total de fibras dentro do músculo. Os investigadores devem, portanto, considerar cuidadosamente a amostragem necessária para suportar todas as conclusões extraídas das experiências. Além disso, a avaliação do impacto de uma intervenção treinamento físico na função de fibra presume que as fibras avaliadas foram de fato recrutadas durante o treinamento. Embora o protocolo tenta imitar o meio intracelular natural da fibra, o processo de permeabilização sarcolema é não-específica e permite necessariamente constituintes intracelulares solúveis de difundir livremente em soluções de banho. Uma outra consequência da permeabilidade da membrana é uma mudança no equilíbrio osmótico evidenciado por um inchaço no volume de fibras 33. Ointumescente de fibras aumenta a distância entre os filamentos de actina e miosina, resultando em sensibilidade ao cálcio reduzida do sistema miofilamentos 34,35, mas pode ser revertida pela introdução de grandes, compostos osmoticamente activos 34. Uma limitação final a considerar é a consequência da técnica utilizada para anexar fibras para o aparelho experimental. Isso invariavelmente requer que distorcem a relação espacial dentro do sistema filamento em e perto dos pontos de fixação, com pessoas vão déficits funcionais. Especificamente, as regiões da fibra no e adjacente aos pontos de fixação estão funcionalmente comprometidas e, assim, contribuir série artefatual elasticidade ao sistema de medição. Em resumo, descrevemos um meio pelo qual se pode avaliar a capacidade de geração de força de quimicamente permeabilizadas fibras musculares esqueléticos in vitro. Embora o foco deste artigo foi sobre a avaliação da força isométrica máxima generatincapacidade g de fibras de músculo esquelético humano, a abordagem experimental pode ser modificado e ampliado para determinar uma variedade de parâmetros cinéticos e relacionamentos em toda uma gama de espécies de mamíferos, ou de outra forma.

A função primária do músculo esquelético é de gerar força. Força muscular é provocada in vivo através de uma complexa seqüência de eventos que inclui os potenciais de ação dos nervos motores, a transmissão neuromuscular, potenciais de ação das fibras musculares, liberação de cálcio intracelular e ativação do sistema de proteínas reguladoras e contráteis. Porque a geração de força é o resultado final desta sequência, um défice em vigor pode ser causado por uma falha de um ou mais dos passos individuais. Um atributo chave de preparação de fibras permeabilizadas é que elimina a maior parte das etapas necessárias para a geração de força in vivo, com apenas as funções de regulação e contrácteis associados com o aparelho restante miofibrilar. O investigador assume o controlo sobre a entrega de cálcio e ativação de energia (ATP), e é recompensado com um sistema simplificado que permite a avaliação das estruturas reguladoras e contráteis isolado em sua co nativanfiguration. Medidas de força, utilizando fibras musculares esqueléticas permeabilizadas são, portanto, valioso ao avaliar alterações na função muscular observadas in vivo. Por exemplo, temos utilizado essa técnica para caracterizar a capacidade de geração de força de fibras de miostatina camundongos deficientes 1 e para avaliar a causa da fraqueza muscular persistente exibiu seguinte crônica do manguito rotador lágrimas 2,3. Metodologia de fibras permeabilizadas moderna pode ser atribuída ao início dos estudos influentes 4,5 e está atualmente em uso por um número de grupos de pesquisa. Embora as técnicas têm sido descritas na literatura, eles ainda não foram apresentadas em formato de vídeo. O objetivo deste artigo é ilustrar, uma técnica válida e confiável atualizada para medir a capacidade máxima de geração de força de fibras individuais a partir de amostras de músculo esquelético quimicamente permeabilizadas. Para conseguir isso, um segmento individual de fibra (aqui referido como um ̶0; fibra &quot;) é extraído a partir de um pacote pré-permeabilizadas de fibras e colocado numa câmara experimental contendo uma solução de repouso, a característica definidora de que é uma concentração de cálcio que é &lt;10 nM. A fibra é então ligado numa extremidade a um transdutor de força-e na outra extremidade a um comprimento-controlador. Com a fibra mantida a um comprimento sarcómero óptima, a mesma é transferida para uma solução de activação que tem uma concentração de cálcio suficiente para induzir a activação máxima e assim a máxima força de contracção isométrica. Força dados são adquiridos, armazenados e analisados ​​utilizando um computador pessoal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Saudáveis, fibras quimicamente permeabilizadas individuais devem aparecer uniforme em forma e ter um intervalo entre estrias consistente quando visto sob alta ampliação. As fibras que são inflexíveis quando manipulado com a pinça ou com danos estruturais óbvios deve ser descartado. Imagens digitais de alta ampliação tomadas durante a etapa 15 são analisadas por 5 medições de diâmetro emparelhados ao longo da barriga da fibra. Fibra CSA é estimada assumindo uma secção transversal elíptica e uma média de 5 medições CSA individuais conforme mostrado na Figura 7A. Figura 7B também serve para ilustrar a forma como as dimensões da fibra em uma vista pode ser significativamente diferente, em comparação com as dimensões emparelhados na outra vista (isto é, transversal seções não são, em geral, e volta). Vestígios força representativos de fibras lenta e rápida humanas são mostrados nas Figuras 8A e 8B, respectivamente. Voltage de saída do transdutor de força-é adquirida durante o teste e convertido para forçar (MN) utilizando o software de aquisição de dados e análise (LabVIEW). A Figura 9 ilustra o método utilizado para avaliar a força activa máxima (Fo), que é calculado subtraindo a força necessária para manter a fibra com comprimento de sarcômero ideal, enquanto em um estado relaxado (força passiva, F P), a partir da maior força isométrica desenvolvida durante a ativação de fibra máxima (força total F T). Uma vez que a saída do transdutor de força-que corresponde à força zero é, em geral, diferente para cada uma das diferentes câmaras de banho, fazemos uma breve distender a fibra em ambos os pré-activação e activação soluções para capturar o nível da força de zero no registro experimental. A normalização da força máxima ativa por fibra CSA é usado para gerar o valor mais informativo de força específica (SF o). Porque leva em consideração o CSA da fibra, o sF </sub&gt; fornece uma medida da capacidade de geração de força intrínseca do aparelho contráctil da fibra, permitindo assim comparações funcionais entre fibras de diferentes tamanhos. Deve, contudo, notar-se que as medições de CSA não é capaz de distinguir a proporção da fibra ocupada por filamentos contrácteis contra a proporção ocupada por outras estruturas subcelulares. As características típicas de adultos saudáveis, fibras de 2,011 Claflin et al. 10 de humano, Mendias et al., 2011 1 de rato e Gumucio et al., 2012 2 para o rato são detalhadas na Tabela 3. Todos os dados apresentados na Tabela 3 foram gerados utilizando o técnicas descritas neste artigo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Humano (Vasto lateral) </strong&gt; </td><td> Rato (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rato (Infra) </td></tr><tr><td colspan="2"> Masculino </td><td colspan="2"> Feminino </td><td> Masculino </td><td> Masculino </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (Não identificado) </td><td> (Não identificado) </td></tr><tr><td> CSA (2 uM) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F O (mn) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. As características típicas de adultos saudáveis, fibras de músculo vasto lateral humano 10, rato extensor longo dos dedos 1 e 2 infra rato músculos. Comprimentos de sarcômero Optimal foram fixados em 2,7 mm para fibras humanos 7,8 e 2,5 mm tanto para rato (36, 37) e fibras de rato (38). Gamas Experimental L F (25 º e 75 º quartis) foram 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm e 1,32-1,59 mm para humanos, ratos e ratinhos, respectivamente. Intervalos mostrados indicam os dias 25 e 75 th quartis e n ​​é o número de fibras testadas. Os problemas mais comuns experimentados durante os testes incluem um deslizamento laço de sutura, o que resulta em uma força response com um &quot;captura&quot;, tal como o ilustrado na Figura 10A, e um rasgo de espessura parcial ou total da fibra, o que resulta em uma resposta força que retorna bruscamente na direcção de ou para (pausa) zero, enquanto a fibra ainda está imerso na solução de activação (Figura 10B). Se um deslize, lágrima ou ruptura ocorre durante um experimento, a fibra deve ser descartado e os dados excluídos, embora mantendo um registro de falhas de fibra também pode ser informativa 11. Outro resultado negativo que pode ser encontrada é a activação prematura da fibra enquanto no pré-activação de solução (Figura 10C). Activação parcial na solução de pré-activação sugere contaminação cruzada bem significativa (isto é, um aumento na concentração de cálcio não intencional no pré-activação bem). Neste exemplo, todos os banhos deve ser aspirado e bem lavado com água desionizada. A secagem das superfícies divisórias entre as câmaras também é recoded como umidade ou condensação nessas áreas pode levar à absorção da solução entre banhos. A decisão de incluir ou excluir dados dependerá em última análise o foco experimental e deve, portanto, ser considerado na concepção do estudo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: laço de sutura (10-0 monofilamento de nylon de sutura). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissecação Bundle Fórceps estão na mão esquerda, tesouras microdissection estão na mão direita. A linha vermelha indica a orientação favorável do punho e da tesoura com os eixos longitudinais das fibras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) aparelho de teste com componentes marcados. (A) câmaras experimentais com fundos transparentes. (B) Comprimento-controlador. (C) Force-transdutor. (D) fonte de luz. (E) Comprimento-controlador da unidade micrômetro xyz com display digital. (F) unidade Stage micrômetro com display digital. (G) Force-transdutor unidade xyz micrômetro. (H) Plataforma de tela alvo laser de difração calibrado. Tabela isolamento (i) da vibração. (B) Opinião do Close-up das câmaras experimentais. Superfície (j) de fixação de aço inoxidável estendendo-se desde o controlador comprimento. Superfície (k) de fixação de aço inoxidável estendendo-se desde o transdutor de força. (L) Side-view prisma. (M) Habitação para os módulos de refrigeração termoelétrica. (N) Termopar para relatar te câmaramperatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificado 100 ponta da pipeta ul usado para transferir fibra de dissecção prato para a câmara experimental. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montagem de fibra única para aparato experimental (A) Gonzos para suturas preparadas enroscada superfícies de fixação de aço inoxidável. (B) transferido para a câmara de fibra experimental. (C) A fibra ancoradas às superfícies de fixação de aço inoxidável pelo primeiro par de argolas de sutura com fio de sutura em excesso removida. (D) segundo par de alças metálicas de sutura inseridas por cima de loops primeira sutura e amarrados no lugar. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: comprimento do sarcômero é avaliada pela projecção de um padrão de interferência de laser sobre uma tela de destino calibrado (a) fonte de laser.. (B) Mirror. (C) tela Target. Padrão de interferência (d) Laser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="A Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (a) determinação da área em corte transversal da fibra em comprimento óptimo sarcómero (humano = 2,7 uM). Assumindo uma secção transversal elíptica, a CSA é calculado para cada um dos cinco locais ao longo da fibra de secção mestra e a média das cinco medições individuais é relatado como fibra de CSA. 2a representa diâmetro e é vista de cima<html> um eixo maior da elipse, 2b representa vista lateral de diâmetro e é o outro eixo da elipse. (B) imagens de fibras representativas que ilustram cada um dos cinco medições correspondentes diâmetro tomadas tanto na vista de topo e lateral. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: traços de força representativos do músculo vasto lateral humano saudável fibras musculares (A) Escreva uma fibra (CSA: 5710 mm 2, F o: 0,89 mN e SF o: 156 kPa).. (B) Tipo de fibra 2a (CSA: 9510 mm 2, o F: 1,66 mN e SF o: 174 kPa). Fibra miosina tipo cadeia pesada foi determinado através da utilização de separação electroforética e prata-coloração técnicas 22. oad / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Cálculo da força ativa máxima (F o) (a) vista expandida de resposta vigor fibras durante o indutor de folga circulação de comprimento-controlador iniciado em solução de pré-activação.. F P é a força necessária para manter um comprimento do sarcómero 2,7 um com a fibra em repouso. (B) vista expandida de comprimento-controlador de movimento de indução de folga. Note-se que o F = F T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: deslizamento (A) laço de sutura, evidenciado por um &quot;catch&quot; em vigor traço durante a ascensão da força. Verifique para ter certeza de que estão seguros laços antes de ativar a fibra. (B) ruptura de fibra durante a ativação. Pode ser devido a integridade da fibra pobres ou tratamento fibra agressivo durante sutura lugar de loopmento. (C) a ativação de fibra parcial prematura devido à contaminação da câmara de pré-ativação com Ca 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Análise das propriedades contráteis das fibras musculares esqueléticas, pele quimicamente, ou permeabilizadas oferece um poderoso meio para avaliar a função muscular ao nível da célula muscular único. Neste artigo vamos descrever uma técnica válida e confiável para preparar e testar permeabilizadas fibras musculares esqueléticas in vitro.

Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K visualizações.  University of Michigan Medical School.  Análise das propriedades contráteis das fibras musculares esqueléticas, pele quimicamente, ou permeabilizadas oferece um poderoso meio para avaliar a função muscular ao nível da célula muscular único. Neste artigo vamos descrever uma técnica válida e confiável para preparar e testar permeabilizadas fibras musculares esqueléticas in vitro. 

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Bioengenharia

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparação de Membranas de Luz respondem por um enxerto de superfície combinada e Processo Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.