<p> Os autores agradecem o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de hNSPCs e instrução inicial em sua cultura. </p>

<p class="jove_content"> <em>Nota:</em> Para cultura de rotina do nosso hNSPCs, mudamos 50-100% dos meios de comunicação todos os dias e, geralmente, a passagem deles 01:02 uma vez por semana. A cultura da mídia contém BIT-9500 20%, 1X fatores antibiótico / antimicótico e crescimento (EGF, FGF, PDGF e cada um com 40 ng / ml) em DMEM: F12 media base. </p><p class="jove_step"> Preparando o balão revestido e Dissociar as células </p><ol><li> Para preparar novos frascos para as células várias passagens, casaco T25 frascos com 10 mg / ml fibronectina humana no EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. Direito antes passaging as células, remova a solução fibronectina e enxaguar os frascos com PBS. </li><li> Transferir o velho &quot;condicionados&quot; media a partir de células a ser várias passagens para o novo fibronectina revestido balões (de tal forma que metade do volume final de mídia para cada frasco será o &quot;condicionada&quot; de mídia). Estas condições de cultivo ajudar a manter essas células em seu estado indiferenciado. </li><li> Depois de todos os meios de comunicação é removida das células para ser várias passagens, lavar as células uma vez com PBS. Tome cuidado para não secar as células. </li><li> Adicionar celular dissociação Buffer (CDB) diretamente sobre as células (1,0-1,5 ml para um frasco T25). Incubar as células no buffer por cerca de 5 minutos à temperatura ambiente. Batendo o frasco vai ajudar a acelerar o desprendimento de células. </li></ol><p class="jove_step"> Centrifugação, ressuspensão e Células Plating </p><ol><li> Adicionar soro contendo media (DMEM: F12 com 10% inativado pelo calor soro fetal bovino) (use ~ o volume de 3X CDB) para o frasco com as células destacadas. Remova a mídia e as células para um tubo de 15 ml. Use um pequeno volume de soro fresco contendo mídia para lavar o balão e recuperar as células residual. </li><li> Centrifugar a mídia e as células a 1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos. </li><li> Sucção fora da mídia contendo soro e ressuspender as células em meio de cultura fresco, pipetando para cima e para baixo para fazer uma suspensão celular homogênea. </li><li> Transferência de metade das células ressuspenso em cada frasco novo para um split 1:2. Anote o número de nova passagem sobre o frasco. </li></ol>

<ol>
	<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins.">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> <em style='font-style: italic'>J. Neurosci. Res</em>. <b>83</b>, 845-856 (2006).</li><li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+culture.">Neural stem cell culture.</a> <em style='font-style: italic'>Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide</em>. , (2007).</li><li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death.">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> <em style='font-style: italic'>Nature</em>. <b>411</b>, 42-43 (2001).</li><li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex.">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>74</b>, 838-851 (2003).</li></ol>

<p> Descobrimos que este protocolo proporciona culturas confiável de hNSPCs. Um fator crítico para as nossas células é que elas precisam ser mantidas como culturas bastante densa e não pode ser várias passagens a tal ponto que as células são esparsas. Em nossas mãos, culturas esparsas crescem muito lentamente ou deixam completamente de se dividir. Por essa razão, costumamos dividir nossas culturas 1:2 ou 1:3 quando uma cultura é extremamente densa. Superfície do revestimento de uma placa de cultura com fibronectina é importante, po...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>09500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EMEM (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>MT-10-010-CV</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF, human basic recombinant</td>
<td>Reagent</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-18B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDGF-AB</td>
<td>Reagent</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-00AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGF, human recombinant</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40052</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>Cell Culture Flask, 25 cm2</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>10-126-28</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin, human, natural</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40008A</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>Human Neural Stem/Precursor Cells</td>
<td>Cells</td>
<td>National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Dissociation Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13150-016</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>
		

passaging human neural stem cells

<p class="jove_content">A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro fornece um meio para investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos, bem como para explorar muitos processos fundamentais do desenvolvimento neural humana e patologia. Este protocolo apresenta um método simples de cultura e hNSPCs passaging na esperança de padronizar esta técnica e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa sobre células estaminais humanas. O hNSPCs usamos foram isolados a partir de cadáveres córtex cerebral pós-natal pela Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional e cresceu como adepto culturas em frascos revestidos com fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nós nossa cultura hNSPCs em DMEM: F12 sem soro meios suplementados com EGF, FGF, PDGF e passagem e eles 1:02 aproximadamente a cada sete dias. Utilizando essas condições, a maioria das células na cultura manter uma morfologia bipolar e expressam marcadores de células indiferenciadas as células-tronco neurais (como nestina e Sox2).</p>

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Passaging Human Neural Stem Cells

<p class="jove_content">A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.</p>

Passaging células-tronco neurais

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K visualizações.  University of California, Irvine (UCI). A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.