Geral Recomendamos descongelamento não mais do que uma amostra em um determinado momento para garantir uma fácil manipulação. O manipulador deve tomar cuidado para não deixar culturas à temperatura ambiente e baixas emissões de CO2 por longos períodos de tempo. Todos os centrifugação de células vivas é feito em 500-600 xg por 5 min à temperatura ambiente. MEFs (células embrionárias de camundongos Feeder) <ol><li> Pré-aquecer media MEF a 37 ° C. Remover o frasco MEF de -80 ° C e imediatamente mergulhe a metade inferior do tubo em banho-maria a 37 ° C. Deve ter cerca de 30-45 segundos antes de as células são descongeladas 80% (porção pequena congelados esquerda). </li><li> Rapidamente trazer o tubo para a capela de fluxo laminar, lavar com álcool a 70%, e de transferência de células pré-aquecido mídia. </li><li> Aspirar a solução de gelatina a partir de chapas preparado anteriormente. </li><li> Alíquota de 2 ml de solução de MEF em uma queda de maneira sábia em cada um dos seis poços. Certifique-se de distribuir o MEFs uniformemente sobre o bem. Data da placa MEF, e coloque em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para permitir MEFs para anexar ao prato. </li><li> Após 6 horas MEFs será anexado ao prato. É melhor usar placas MEF 24-48 horas após o plaqueamento. NÃO use uma placa MEF que tem mais de 4 dias de idade. </li><li> Pré-aquecer meios tons e 0,05% Tripsina / EDTA a 37 ° C Sob o capô, prelabel um tubo estéril 50 ml. </li><li> Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação tonalidades da cultura a ser dividida. Delicadamente, lave os poços com 2ml de solução de 1X tampão fosfato (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 0,75 ml 0,05% Tripsina / EDTA para o bem. </li><li> Substituir a tampa, e observar as células sob a ampliação de 4x. O MEFs redor das colônias MATIZ deve começar a retrair. Quando o MEFs são suficientemente arredondadas e as fronteiras das colônias tons são ásperas, devolver o prato para o capô. Este processo deve levar cerca de 5 minutos, absolutamente não mais que 10 minutos ou suas células não vai voltar a crescer. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo, lavando o fundo do poço, até que a monocamada MEF foi completamente isolada (monocamada é pegajoso e podem permanecer em uma única peça). </li><li> Transferir a suspensão celular a um tubo de 50 ml contendo mídia adicional matizes. Girar o tubo de células 500xg por 5 minutos, Aspirar fora da mídia, tenha cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> A placa em um novo prato de MEFs, adicionar o volume adequado de células para determinada mídia adicional matizes, e pipetar a solução 5-7 vezes com uma pipeta automática. </li><li> Remova a mídia MEF de uma placa fresca de MEFs. </li><li> Alíquota a queda solução MATIZ sábio para cada poço, certificando-se de distribuir as gotas uniformemente sobre o bem. Sem agitar o prato, cuidadosamente as células voltem ao a 37 ° C durante a noite para deixar incubadora MATIZ semente colônias. </li><li> MATIZ células saindo de uma separação deve se comportar de forma semelhante aos saindo de um degelo. </li></ol>

<ol>
	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

Neste vídeo demonstramos como nós MATIZ rotineiramente passagem humana linhas de células-tronco embrionárias em nosso laboratório. Divisão eficiente e regular e passaging é essencial para manter uma saudável linha de células estaminais embrionárias humanas. Tripsina passagem mediada é uma vantagem significativa de linhas de células MATIZ, no entanto, é importante não para mais de trypsinize culturas ou ter uma grande proporção de células isoladas durante a re-tecendo.

MATIZ media 651,5 ml KO-DMEM 500 ml 6,5 ml PenStrep GlutaMAXTM 6,5 ml 6,5 ml NEAA 2-mercaptoetanol 0.5ul KO substituição Serum 65 ml 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / mL final) 0,65 ml

passaging hues human embryonic stem cell-lines with trypsin.

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina. Células estaminais embrionárias humanas são artefatos da cultura celular, e tendem a adquirir anormalidades cariotípicas com duplicações populacional. Passaging adequada é essencial para manter uma alimentação saudável, indiferenciado, tons karyotypically normais embrionárias humanas de cultura de células-tronco. Primeiro, uma cultura em expansão é lavado em PBS para remover a mídia residuais e restos celulares, em seguida, as células são cobertas com um volume mínimo de 0,05% quente Tripsina-EDTA. Tripsina é deixado sobre as células por até cinco minutos, e depois as células são delicadamente desalojado com uma pipeta 2 mL sorológicos. A suspensão de células é coletada e misturada com um grande volume de mídia matizes, em seguida, as células são coletadas por centrifugação suave. A mistura de tripsina inativada mídia é removido e as células ressuspendidas em meio pré-aquecido matizes. Uma razão de separação adequada é calculada (geralmente 1:10 - 1:20), e células re-banhado em uma placa 1-2 dia de idade contendo uma monocamada de células irradiadas do mouse alimentador embrionárias fibroblastos. A placa de cultura recém-semeado matizes é deixado em repouso por 48 horas, então a mídia é trocada a cada dia depois disso. É importante não trpsinize para baixo a uma suspensão de células individuais, pois isso aumenta o risco de introdução de anormalidades cariotípicas.

Watch this Scientific Journal Video about Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin. at JoVE.com

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

passaging-hues-human-embryonic-stem-cell-lines-with-trypsin

Research

JoVE Journal

Biology

251.7K visualizações.  Harvard. Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.