<p> Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC. </p>

<p> <strong>Nota:</strong> Consulte o artigo <strong>Neural Stem Passaging Humanos Cells</strong> ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ea <strong>Human Neural Stem Contando</strong> artigo <strong>Cells</strong> ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs. </p><p class="jove_step"> Preparação </p><ol><li> Certifique-se que há uma abundância de células disponíveis para transfecção (vários milhões de células para cada DNA a ser transfectadas). </li><li> Revestimento de um prato de cultura de tecidos, no qual as células transfectadas serão distribuídos, com 10 mg / ml fibronectina humana na noite anterior transfecção. Direito antes de iniciar o protocolo de transfecção, remova a fibronectina, lavar o prato com PBS, e media o lugar da cultura no prato. Deixe o prato no 37 ° C a cultura de tecidos incubadora para aquecer a mídia. Além disso, coloque 1 ml de meios de cultura na incubadora para pré-aquecer a 37 ° C. </li><li> Coloque o DNA (s) a ser transfectadas, e solução de transfecção (de Amaxa), sobre o gelo. </li></ol><p class="jove_step"> Transfecção </p><ol><li> Lavar um número definido de células com PBS (geralmente usamos ~ 5 x 106 células por transfecção). Agregar as células por centrifugação (1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos), retire como PBS tanto quanto possível, e ressuspender o pellet celular em 100 ml da solução de transfecção fornecido com o kit de transfecção. Transferir a suspensão de célula para um tubo eppendorf 1,7 ml. </li><li> Adicionar 5 l do DNA (~ 5-10 mg de DNA por transfecção) para a suspensão de células e misture delicadamente. </li><li> Usando o Amaxa mini-pipeta, transferir a mistura de células-DNA na cuvete transfecção Amaxa. Certifique-se que 1 ml de mídia pré-aquecido a cultura para a próxima etapa. Além disso, remova o prato com meios de cultura de células da incubadora e colocá-la na capa de cultura de tecidos. </li><li> Coloque a cuvete no Nucleofector, gire a roda no sentido horário, e seleccione programa &quot;A-033&quot;. Pressione <em>Enter.</em> </li><li> A transfecção de sucesso é indicada pela presença de uma camada muito densa de bolhas no topo da solução na cuvete. Adicionar 500 mL de mídia quente na cuvete, e usando o Amaxa mini-pipeta, transferir as células transfectadas no prato com pré-aquecido mídia. Lavar a cuvete com a mídia mais morna e adicione a água para o mesmo prato. Coloque o prato com as células do tecido 37 ° C a cultura incubadora. </li></ol>

<ol>
	<li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells.">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods</em>. <b>33</b>, 151-163 (2004).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+Human+Neural+Stem+Cells.">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Visualized Experiments</em>. <b>7</b>, (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+Human+Neural+Stem+Cells.">Counting Human Neural Stem Cells.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Visualized Experiments</em>. <b>7</b>, (2007).</li></ol>

<p> Este protocolo descreve um procedimento de transfecção relativamente rápida e eficiente para hNSPCs. Usando este procedimento, obtivemos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35%. Células transfectadas por este procedimento pode ser usado para estudos de curto prazo (células transfectadas transitoriamente) ou para estudos de longo prazo se um agente de seleção é usado para gerar uma população estável transfectadas. Geramos células transfectadas estavelmente em que ~ 70% das células expressam a proteína exógena. Em hNSPC...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>The Nucleofector Device</td>
<td>Tool</td>
<td>Amaxa</td>
<td>AAD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse neural stem cell nucleofector kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Amaxa</td>
<td>VPG-1004</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>
		

transfecting human neural stem cells with the amaxa nucleofector

<p class="jove_content">Transfecção de células primárias de mamíferos neural, tais como tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), comumente usado com os reagentes de transfecção catiônicas lipídicas resultou muitas vezes na viabilidade celular pobres e eficiência de transfecção baixo. Outros métodos mecânicos de introduzir um gene de interesse, como uma arma gene ou microinjeção, também são limitados pela viabilidade celular pobres e baixos números de células transfectadas. A estratégia de usar construções viral para introduzir um gene exógeno em células primárias tem sido condicionada pela quantidade de tempo e trabalho necessário para criar vetores virais e preocupações de segurança em potencial. Descrevemos aqui um protocolo passo a passo para transfecting hNSPCs utilizando dispositivo Nucleofector Amaxa e tecnologia com os parâmetros elétricos atuais e soluções tampão especificamente otimizados para transfecting células-tronco neurais. Usando este protocolo, conseguimos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35% e ~ 70% após transfecção estável. O protocolo envolve combinando um elevado número de hNSPCs com o DNA para ser transfectadas no buffer apropriada, seguida de eletroporação com o dispositivo Nucleofector.</p>

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Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

<p class="jove_content">Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.</p>

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

transfecting-human-neural-stem-cells-with-the-amaxa-nucleofector

Research

JoVE Journal

Biology

23.4K visualizações.  University of California, Irvine (UCI). Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.