Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lars Philipsen para ajudar com a otimização dos filmes intravital, Dr. Jonathan Lindquist para ler cuidadosamente o manuscrito, e todos os membros do laboratório Gunzer para discussões úteis e comentários durante o desenvolvimento do método. Este trabalho foi financiado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) para MG

1. Infecção <ol><li> Conídios inchados de Aspergillus fumigatus (ATCC 46645) são gerados por pré-incubação em RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Alemanha), suplementado com 5% FCS (v / v). 2x10 7 conídios de descanso são ressuspendido em 5 ml de meio e incubados em uma placa de cultura de tecidos bem-6 (TPP AG; Trasadingen, Suíça, catalogo 92.006) por 7h a 37 ° C. </li><li> Após o período de inchaço, os esporos são fluorescente etiquetado, adicionando 10 ml de solução estoque calcofluor branco (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemanha, catalogo F3543; [25 mg / ml] em DMSO) a cada um contendo Aspergillus bem no 6-bem placa, atingindo uma concentração calcofluor final de 50 mcg / ml RPMI. Após a mistura suave, os esporos são incubados por um adicional de 15 min a 37 ° C. </li><li> Na próxima etapa, os esporos são colhidas por filtração através de um filtro de 70 mM de células (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Depois de lavar uma vez com 10 ml de PBS (centrifugue a 900xg por 5 min à temperatura ambiente), o pellet é ressuspendido em 2 ml de PBS, eo número total de conídios inchados determinada contando com uma câmara de Neubauer. Finalmente, a suspensão de esporos é girada para baixo em 900xg por 5 min à temperatura ambiente, o sobrenadante é cuidadosamente removido eo pellet ressuspenso para a concentração final de 1x107 esporos por 100 mL de PBS. </li><li> Para a infecção, 100 ml de solução de esporos é aplicada intratraqueal em camundongos fêmeas (C57/BL6, 8-10 semanas de idade, Harlan, Alemanha). Se os neutrófilos são a serem observados, bem como, o uso de Lys-EGFP ratos, levando EGFP sob o promotor lisozima 1 é recomendado. Comece por anestesiar o animal com uma injeção única de 150 ip solução cetamina / Rompun mL (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemanha (cetamina) e Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemanha (Rompun), 1 ml cetamina [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml estéril NaCl [0,9%]). 5 minutos mais tarde o rato anestesiado pode ser fixado com um elástico pelos seus dentes para a rampa de acesso (ou seja, uma superfície inclinada) para facilitar a intubação (suplementar figura 1). Utilizando uma pinça, a língua é puxada para um lado e um cateter venoso 22G habitação (B. Braun AG, Melsungen, Alemanha, Vasofix Braunüle) pode ser gentilmente inserido na traquéia sob iluminação permanente com uma lâmpada no pescoço de ganso. A inserção bem sucedida do cateter é verificada pela observação movimento regular do tórax do animal com a freqüência do ventilador mecânico. Quando a intubação sucesso foi confirmado, 100 mL de suspensão de esporos é aplicado utilizando uma micropipeta 100 ul. Este volume deve ser inaladas pelo animal, sem qualquer ajuda adicional em 1-2 s. Uma distribuição maior de partículas de fungos dentro do pulmão é conseguido através de ventilação mecânica do animal infectado por 2 minutos com um respirador para pequenos animais (MiniVent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Alemanha) a uma taxa de 250 respirações por minuto e um volume de inalação de 300 mL por respiração (suplementar figura 2). Após a infecção os animais são devolvidos às suas gaiolas e observados a cada 5 minutos até ambulatorial novamente. Camundongos não mostram qualquer evidência de dor ou sofrimento durante o período de incubação seguinte. </li></ol> 2. Preparação de pulmão <ol><li> 7 h após a infecção com os esporos, o animal é sacrificado por uma overdose de isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Alemanha), até os movimentos ea respiração cessaram há mais de 30 segundos. Esta é seguida por toracotomia como um método secundário para garantir a morte clínica e permita a visualização e acesso da traquéia e pulmões. Em seguida, o peito é cuidadosamente abriu para expor o pulmão e do trato respiratório superior. Em seguida, outro cateter venoso 22G habitação é inserido na traquéia a partir da epiglote expostos. Através deste túbulo os pulmões são preenchidos com 1 ml pré-aquecido baixa temperatura de fusão agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Alemanha), utilizando uma seringa de 1 ml Omnifix (B. Braun). Assim como os pulmões estão cheios da traquéia é amarrado com um pequeno pedaço de fio de costura e todo o animal é colocado em um refrigerador a 4 ° C. </li><li> 15 min depois, quando a agarose solidificou, todo o pulmão é extirpado início da traquéia. Usando um par de tesouras afiadas pontas, o lobo do pulmão direito é posteriormente removido, a superfície inferior é brevemente secos em uma folha de papel de seda e, em seguida, o lobo inteiro está colado ao bloco de preparação de um (Campden Instruments, Reino Unido, vibratome 752M Vibroslice ), utilizando uma gota de cola de tecido para fixação (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha, Roti-Coll 1). Após 1 min o bloco é instalado na câmara de corte do vibratome, que é preenchido com pré-refrigeradas (4 ° C) PBS. O vibratome é definida como uma vibração mid-range (5 out of 10 max.) E também a velocidade moderada (5 out of 10 max.) Tal que uma seção transversal horizontal dade pulmão é produzido. A metade superior do órgão é então transferido para uma pequena placa de Petri de plástico (5 cm de diâmetro) onde ele é invertido e fixada com uma máquina de lavar self-made plana (1 cm de diâmetro interno) que é coberta por um conjunto de fios de nylon paralelos, cada 1 mm de distância (figura suplementar 3). Finalmente a placa de Petri é preenchido com 10 ml de PBS suplementado com 10 ml do corante DNA Sytox Orange [mM 5] (Invitrogen, Alemanha), resultando em uma concentração final de 5 mM de corante. </li></ol> 3. 2-fótons microscopia a laser <ol><li> Placa de Petri contendo a amostra de pulmão é, então, instalado sob a objetiva do microscópio para que o buffer pode ser aquecido a 37 ° C por um sensor de temperatura controlada aquecedor (suplementar figura 4). 2-fótons de microscopia é então realizada sobre a superfície de corte inteira usando um microscópio Zeiss LSM 710 NLO em uma posição vertical estágio Examiner Axio equipada com uma lente de água 20xNA1.0 dipping (Zeiss, Jena, Alemanha). Para geração de imagens, diferentes áreas ao longo da seção são digitalizados para 400 M de profundidade usando um comprimento de onda de 800 nm iluminação detectar verde (530 nm) e vermelho (580 nm) de fluorescência, bem como a geração de segundo harmônico (SHG) de sinal eo azul calcofluor fluorescência (emissão de 400-470 nm), com detectores externos não descanned (NDD). Além de 2-D imagens e filmes lapso de tempo (1 imagem a cada 5-10 segundos), único ou repetitivo stacks 3-dimensional da imagem pode ser posteriormente processado como renderings voxel ou simples imagens foco estendido ou 4-D de dados (3D ao longo do tempo), utilizando pacotes de software diferentes. Esta configuração microscópica permite a observação do comportamento celular em um ambiente quase intacta que, uma vez que constitui a porta de entrada para uma variedade de organismos patogênicos, é de relevância imunológica enorme. Motilidade celular, fagocitose e produção endógena NET por neutrófilos após a infecção com o molde Aspergillus fumigatus pode ser facilmente investigada sob essas condições in situ. </li></ol> 4. Resultados representante Se feito corretamente a imagem irá gerar 2 - ou 3 cores slides ou filmes. Apesar de coloração é feita em um procedimento pós-processamento e é, portanto, livremente adaptável, que geralmente selecionar um esquema de cores que reflecte a cor natural do corante / sinal, que é detectado no canal relativa. Assim, os corantes Sytox são retratados em vermelho, o fungo, assim como o sinal de SHG é mostrado em azul e, se presente, EGFP marcado células são coradas em verde. No primeiro exemplo (Fig. 1) o sinal de SHG azul retrata as fibras do tecido de um pulmão de não-infectados e o sinal vermelho Sytox é produzida por núcleos de células do pulmão residente na corte aberto pela vibratome. No segundo exemplo (Fig. 2) um pulmão infectado é mostrado, onde ambas as estruturas, alveolar, assim como massas fúngicas, aparecem em azul, enquanto núcleos e redes são manchados de vermelho. O terceiro exemplo (Fig. 3) é de um animal transgênico Lys-EGFP onde para além das estruturas de azul e vermelho os neutrófilos verde também pode ser visto. A migração de neutrófilos e sua fagocitose de elementos individuais de fungos em sequências de lapso de tempo é mostrado no filme suplementar. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A aparência de uma fatia de pulmão de não-infectados em 2 cores-2-fótons microscopia. Uma fatia de pulmão foi preparado a partir de um não-infectados C57/BL6 mouse e fotografada, como descrito no protocolo. Aqui apresentados são o sinal de SHG da estrutura do tecido alveolar (A), o sinal Sytox de núcleos celulares cortado durante a preparação da fatia de pulmão (B), e uma sobreposição dos dois canais (C). A área de box em (C) é visto ampliado em (D). Por favor, anote o tecido fibroso na parte inferior do pulmão fatia em comparação com a organização claramente alveolar nas áreas de respiração ativa do pulmão acima. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A aparência de uma fatia de pulmão de um animal do tipo Aspergillus selvagens infectadas em 2 cores-2-fótons microscopia. Uma fatia de pulmão de um rato infectado C57/BL6 7 h antes com A. fumigatus foi preparado e fotografado como descrito no protocolo. Mostrado é a estrutura combinada de fungos e SHG do tecido alveolar (A), o sinal da NET Sytox DNA, bem como núcleos de células cortado durante a preparação da fatia de pulmão (B), e uma sobreposição dos dois canais (C) . A área de box em (C) é visto ampliado em (D). Por favor note, as áreas claramente distintas das massas fúngicas, alvéolos, e NET-estruturas são marcadas com as letras F, A e N, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A aparência de uma fatia de pulmão de uma pessoa infectada Aspergillus animais Lys-EGFP em 3 cores microscopia 2-fótons. Uma fatia de pulmão de um rato Lys-EGFP infectou 7 h antes comA. fumigatus foi preparado e fotografado como descrito no protocolo. Mostrado é a estrutura combinada de fungos e SHG do tecido alveolar (azul), o sinal Sytox de núcleos celulares e redes (vermelho), bem assim como diversos neutrófilos (verde). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figura 4" /> Suplementar figura 1. Fixação do mouse para a intubação. Sob cetamina / Rompun anestesia do animal é fixa com um elástico em seus dentes, a fim de facilitar a intubação com cateter 22G habitação venoso. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figura 5" /> Suplementar figura 2. Ventilação mecânica do mouse. O mouse intubados está infectado por um aplicativo que de 1x10 7 esporos ressuspenso em 100 mL de PBS. Uma distribuição maior de partículas de fungos dentro do pulmão é conseguido através de ventilação mecânica o rato infectado com um respirador para pequenos animais. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figura 6" /> Suplementar figura 3. Fixação do pulmão do lóbulo. Após a preparação do lobo do pulmão direito o órgão é fixado em uma placa de Petri pelo uso de uma arruela de laboratório feitos plana que é coberto por um conjunto de fios de nylon paralelos. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figura 6" /> Suplementar figura 4. 2-fótons de configuração de imagem. A placa de Petri contendo o lobo do pulmão direito é instalado sobre um tapete de aquecimento sob o microscópio dois fótons após a adição do corante DNA Sytox Orange. Filme suplementar:. Neutrófilos Os neutrófilos que migram e phagocytosing elementos fúngicos nos pulmões Aspergillus infectados visto por lapso de tempo de 2 fótons de microscopia de um pulmão fatia de vida 7 h após a infecção com o fungo são verdes, elementos fúngicos e SHG são azuis, e núcleos de células como bem como NET-estruturas são representadas em vermelho. O tempo real do experimento é mostrado no canto inferior direito. A barra de escala representa 50 mm. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">Clique aqui para assistir ao vídeo</a>

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	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

Microscopia em tempo real 2-photon in vivo ou em órgãos intactos ganhou importância profunda em estudos sobre a fisiologia das células do sistema imunológico ao longo dos últimos 10 anos. Foi com esta técnica que os eventos importantes, como a dinâmica de ativação de células T nos gânglios linfáticos primeiro tornou-se visível 2-4. Mais recentemente, os pesquisadores também começaram a analisar funções celulares específicas, como os primeiros passos na geração de células efetoras nos tecidos linfáticos usando essa abordagem 5. No entanto, apesar de uma série de novos conceitos biológicos foram revelados através deste método, ainda há questões importantes e desafiadoras para as quais não existem estudos visualização intravital foram publicados até agora. Isso se aplica principalmente para o pulmão de mamíferos. O aspecto interessante deste órgão, como porta de entrada para uma variedade de organismos patogênicos, torna-se uma das superfícies mais crucial em que processos imunológicos ocorrem no corpo dos mamíferos. Com cada respiração durante a vida inteira, as partículas não desejadas são inalados, alguns dos quais têm o potencial de induzir a infecções fatais 6. É auto-explicativo que em um local tão sensíveis e ameaçadas de uma rede apertada de mecanismos de defesa deve estar presente exibindo todo o repertório de respostas imunes. Por outro lado, é muito importante que a luta induzida imunológico contra agentes patogénicos potenciais em tal lugar &quot;sujo&quot; é rigidamente controlado. Reações exageradas do sistema imunológico têm um alto risco de prejudicar o próprio corpo por maciçamente ferir o tecido do órgão com a estimulação de ações inespecíficas de células imunes 7,8. À luz destes pensamentos que seria extremamente interessante e útil ter a possibilidade de investigar o comportamento das células nos pulmões de mamíferos em verdade, em condições in vivo. No entanto, o fato de que um sistema desse tipo até agora não foi implementado com sucesso aponta claramente para as enormes dificuldades que têm de ser resolvidos na criação de um protocolo de trabalho. O desafio mais exigente, provavelmente, é a estabilidade foco. O pulmão como o órgão responsável pela respiração está sob constante movimento em todas as três direções do espaço para realizar inalação. Esta circunstância por si só causa problemas de imagem grave e pode ser considerado um intravital imagers &quot;pesadelo&quot;. Já um ligeiro movimento para qualquer dimensão no espaço tem um efeito enorme deterioração da visão microscópica, que precisa ser estável com precisão micrométrica, a fim de gerar imagens significativas 9. Dada a sua concentração inerentemente locais apertados 10, microscopia de dois fótons é ainda mais sensível às instabilidades focal, como um deslocamento de uma certa estrutura no intervalo de apenas alguns micrômetros na direção Z é equivalente a uma completa perda de foco e, assim, uma experiência fracassada. O protocolo apresentado neste estudo para a observação de células imunes dentro do pulmão murino ainda não é uma aplicação in vivo, mas sim uma aproximação com a situação em um pulmão funcionalmente intactas 11. Abordagens Ex vivo de linfócitos de imagem, por exemplo, na linfa explantado nós, tem sido demonstrado que produzem resultados equivalentes a verdade em observações in vivo e, portanto, 12 são altamente relevantes 5. O observações in situ em cortes de pulmão, que só são possíveis com a nossa abordagem, realizada em um pulmão infectado logo após excisão. A integridade 3D durante o processo de corte é assegurada pela matriz agarose, um passo essencial para permitir um processo controlado com precisão de corte do pulmão. Embora seja necessário para resfriar o pulmão explantado por um curto período para permitir uma solidificação da matriz de agarose, é possível voltar para perto de condições fisiológicas das células após o corte e reaquecimento do tecido. Isto é claramente demonstrado pelos nossos dados, que demonstram que sob estas condições neutrófilos são muito ativas e exibem todo o seu potencial como fagócitos ágil, que são necessárias para o apuramento efectivo de uma infecção Aspergillus fumigatus. Eles patrulham o tecido pulmonar passando por barreiras epiteliais, a fim de atingir as partes internas dos alvéolos e, além disso eles ativamente assumir esporos de fungos 11. A principal conclusão deste trabalho foi o aparecimento de estruturas semelhantes neutrófilos armadilhas extracelular (NET) no órgão Aspergillus infectados. NET são uma descoberta muito recente de um mecanismo de defesa romance em neutrófilos 13. No entanto, desde sua descrição inicial em 2004, o número de condições fisiológicas ou patológicas em modelos animais ou humanos, onde este fenômeno tem sido observado, ou está faltando foi aumentando explosivamente 14-16. Curiosamente, apesar de tanto trabalho foi gasto nessas estruturas por tantos grupos diferentes, a maioria dos relatórios ainda estão em um nível muito descritivo e não muito ésabe sobre o mecanismo de liberação NET e seu regulamento. Com nosso protocolo pudemos pela primeira vez para mostrar fibras NET em um pulmão infectado. Além disso, conseguimos demonstrar a importância de neutrófilos recém-recrutados, bem como estruturas fúngicas molecular para a sua ocorrência ou inibição 11. Isto mostra claramente o potencial do nosso método para investigar os passos de formação única NET em mais detalhes. Pode-se pensar, por exemplo, usar neutrófilos de camundongos knock-out adequado para observar sua capacidade de formação NET em experimentos de transferência adotiva. Assim, embora a observação directa da imigração de neutrófilos do sangue periférico não é possível com este sistema, devido à falta de fornecimento de sangue depois de explante de órgãos, ainda acreditamos que o nosso protocolo é um método valioso e relativamente fácil de manusear que permite que a imagem de passos cedo ou mais tarde na defesa imunológica contra infecções pulmonares. Este é, portanto, um passo importante para investigar o fenômeno dentro do pulmão de respiração dos animais vivos.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Após o trato gastrointestinal, o pulmão é o segundo maior superfície para a interação entre o corpo de vertebrados e meio ambiente. Aqui, efetiva troca gasosa deve ser mantida, enquanto, ao mesmo tempo evitar a infecção pelos patógenos múltiplos que são inalados durante a respiração normal. Para conseguir isso, um conjunto soberbo de estratégias de defesa humoral e celular combinando mecanismos imunes existe. Uma das medidas mais eficazes para a defesa agudo de pulmão é o recrutamento de neutrófilos, que fagocitam os agentes patogénicos ou inalados ou matá-los, liberando substâncias químicas citotóxicas. A recente adição ao arsenal de neutrófilos é a sua liberação explosiva de DNA extracelular-NET por bactérias ou fungos que podem ser capturados ou inativados, mesmo após a liberação de células NET morreram. Apresentamos aqui um método que permite observar diretamente os neutrófilos, migração dentro de um pulmão recém-infectados, phagocytosing patógenos fúngicos, bem como visualizar a NET extensa que eles têm produzido ao longo do tecido infectado. O método descreve a preparação de espessura de pulmão viável sete horas após a infecção intratraqueal de camundongos com conídios de Aspergillus fumigatus e seu exame pelo multicolor de lapso de tempo de microscopia 2-fótons. Esta abordagem permite investigar diretamente defesa antifúngica no tecido pulmonar nativo e, assim, abre um novo caminho para a investigação detalhada de imunidade pulmonar.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K visualizações.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

Vídeo: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Microondas Assistida Diagnóstico Rápido de Doenças vírus de planta por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Imunologia e Infecção

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Estudo das interacções de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...