O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui descrevemos métodos para avaliar os primeiros estados de cura durante a interação leishmania com as células hospedeiras. Essa técnica apresenta como principal vantagem, permitindo o estudo de diferentes estados da fagocitose leishmania e a participação de diversas proteínas.
Vale ressaltar que essa técnica também pode ser estendida a outros tipos de estudos, incluindo infecção por bactérias, leveduras ou ser engolida por outros tipos de células. As pessoas que tentam essa técnica devem cuidar do tempo de exposição das células à solução Nucleofector. Além disso, sugerimos começar a testar a transfecção usando um máximo de dois plasmídeos.
Demonstrando o procedimento estará Amanda Reboucas, uma estudante de doutorado do nosso laboratório. Para começar, sementes 0,2 milhões de células THP-1, ou macrófagos derivados de monócitos humanos em 500 microliters RPMI por poço em uma placa de 24 poços com tampas de vidro de 13 milímetros. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono, lavar células duas vezes com 0,9% de soro fisiológico e incubar as células em um Meio RPMI Completo.
Adicionar a fase estacionária da espécie Leishmania às células a um parasita de 10 é para uma razão celular hospedeira, e, em seguida, centrífuga a 720 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de incubar as células a quatro graus Celsius por cinco minutos, lave as células duas vezes com solução salina de 0,9% para remover quaisquer promastigotes não internalizados. Incubar as células em RPMI Médio suplementado a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, fixar as células com 4% de PFA por 15 minutos.
Em seguida, as tampas de montagem usam mídia de montagem preferida. Em seguida, conte pelo menos 400 células em campos aleatórios sob um microscópio de fluorescência. Para investigar a biogênese fotovoltaica induzida pela Leishmania, começar a transfetar células THP-1 com plasmídeos semeando 15 milhões de células THP-1 em frascos de cultura tecidual de 75 centímetros quadrados contendo 10 mililitros de Completo RPMI Médio suplementado com 100 nanogramas por PMA mililitro, e 50 micromolars para mercaptoethanol por 48 horas.
Em seguida, lave as células uma vez em solução salina de 0,9% e desprende as células usando uma solução de dissociação celular não enzimática. Em seguida, centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, resuspende as células THP-1 em um mililitro de RPMI Medium e realize contagens em uma câmara de Neubauer.
Centrifugar as células novamente a 250 vezes g por 10 minutos à temperatura ambiente e descartar o sobrenatante. Resuspengem 2 milhões de células em 100 microlitrais da solução Nucleofectora e incubar com 0,5 microgramas do revestimento plasmídeo para a proteína de interesse, marcado com uma proteína fluorescente. Transfira a suspensão contendo células THP-1 e ácido nucleico para o cuvette nucleofectador.
Em seguida, transfete as células usando o programa Nucleofector Y um. Recupere as células transfeinadas e as sementes em 500 microliters de RPMI Medium em 24 placas de poço com tampas de vidro de 13 milímetros. Incubar as células e O Meio RPMI Completo a 37 graus Celsius para 0,5, 2, 4, 6, 12 e 24 horas.
Deixe as tampas de vidro de 13 milímetros à temperatura ambiente e proteja-as da luz pelo menos 30 minutos antes da aquisição. Limpe as tampas com tecido absorvente. Em seguida, adicione uma gota de óleo de imersão ao objetivo e, em seguida, adicione o slide.
Mova o objetivo até que o óleo toque o escorregador. Observe e ajuste o foco no microscópio e escolha a opção 63x objetivo com o óleo. Abra o programa LIQA e ajuste os lasers nos comprimentos de onda 488, 552 e 405.
Selecione a resolução da imagem como 1024 x 1024. Depois de clicar no botão ao vivo, defina a pilha Z e pressione a opção iniciar. Aguarde a aquisição da imagem e selecione a opção, projeção máxima, nas ferramentas.
Salve o experimento e exporte as imagens do formato TIFF para um computador. Os resultados mostraram que tanto a Leishmania Braziliensis LCL quanto a Leishmania Braziliensis DL, também se ligam aos macrófagos. Além disso, não foram observadas diferenças em relação à Leishmania Braziliensis LCL e à fagocitose leishmania Braziliensis DL por células hospedeiras.
O recrutamento de LC3 para o vacuole parasitoforoso, ou PV's, induzido por Leishmania Braziliensis LCL ou Leishmania Braziliensis DL, foi comparado em células infectadas. Após quatro horas de infecção, foram observados percentuais semelhantes de LC3-decorados em Leishmania Braziliensis LCL e Leishmania Braziliensis DL infectados macrófagos. Assim, os resultados mostraram que a Leishmania Braziliensis LCL e a Leishmania Braziliensis DL interagem da mesma forma com macrófagos durante a vinculação, fagocitose e biogênese de PV's no que diz respeito ao recrutamento da LC3.
Imagens microscópicas representativas demonstraram transfecção eficiente de células THP-1 com plc-GFP, Rab5-GFP, plasmídeos Rab7-GFP. As pessoas que experimentam este protocolo devem prestar atenção à incubação de temperatura e proteger as amostras de microscópio da luz, todos os tipos. A modulação da expressão das proteínas identificadas que precipitam a fagocitose leishmania demonstrará a importância dessas proteínas no desfecho da infecção por Leishmania.
Podemos estender essa técnica para diferentes tipos de estudos patológicos e mecanismos associados ao estabelecimento de parasitas e identificação de alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
