Este trabalho é financiado pelo NIH conceder RR021905 P20-01, CF conceder STANTO07R0 RPD, e conceder NASA NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema SESI-MS análise de voláteis bacteriana. O headspace da cultura bacteriana é deslocado pelo CO 2 (1) para a câmara de reação SESI (2). Como os voláteis atravessar a câmara de reação SESI eles passam através da nuvem electrospray e tornar-se ionizado (3). Uma vez ionizado, os voláteis são puxados para o espectrômetro de massa para análise (4). Transportadora de gás em excesso e não reagiu voláteis bacterianas são passados ​​através de um filtro de 0,22 mM (5), como uma medida adicional de proteção, e ventilado para um capuz químico. Detalhe: A agulha electrospray SESI é um capilar de sílica (40 ID mm) com uma ponta de agulha afiada. Como uma demonstração da utilização do SESI-MS para a caracterização de compostos voláteis bacteriana, E. coli K12 e P. PAO1 aeruginosa são cultivadas em aerobiose durante 24 h em 50 mL de Lennox-LB a 37 ° C e os espectros SESI-MS do headspace voláteis são coletados em dois minutos. De dióxido de carbono (99,99%) a uma vazão de 2 L / min é usado como gás de transporte para entrega volátil para a câmara de reação. A câmara de reação SESI era costume construída e preparada para uma API-3000 (SCIEX), substituindo a fonte de íons originais electrospray. Os espectros são recolhidos no modo íon positivo usando 0,1% de ácido fórmico, metanol 5,0%, e 94,9% de água (v / v) como a solução electrospray, entregue em 5 nL / s através de uma sílica não-condutor capilar com uma ponta de agulha afiada (40 ID mm). A tensão aplicada é de 2,5 kV. Analista de software 1.4.2 (Applied Biosystems) é usado para a coleta de dados com os seguintes parâmetros: 20 - 500 Da, MCA modo, 40 scans, 3 s / scan, e 2 min tempo de análise total. 1. Sistema de cultivo <ol><li> Escolha a embarcação apropriada para o cultivo de suas culturas, considerando as necessidades de crescimento da espécie em sua experiência (por exemplo, aeração, temperatura, luz, etc), bem como a prestação eficiente de voláteis para o espectrômetro de massa. As garrafas de cultura que escolhemos para uso são padrão de 100 ml frascos Pyrex mídia equipados com tampas de rosca que têm pelo menos duas portas luer. Uma linha de entrada é inserido através de uma porta luer para entrega transportadora de gás para o frasco da amostra e uma linha de saída é inserido através de outra porta para entrega de COV para o instrumento (Figura 1). Qualquer portas adicionais estão conectados. </li><li> Antes de cultivo das amostras, pressionar os vasos e submergir na água para verificar vazamentos. Fugas de gás são a principal causa de resultados atípicos na forma de sinais fracos ou ausentes ion volátil. </li></ol> 2. Experimento biológico: set-up e segurança considerações <ol><li> Crescer o seu culturas nas condições adequadas à sua hipótese. Recomenda-se que pelo menos dois biológicos repetições, cada uma com dois técnicos repetições, são usados ​​para cada variável. </li><li> Prepare um espaço em branco para cada condição de cultura (meio, antibióticos, etc) e incubar os em branco sob as mesmas condições que as suas amostras. </li><li> Empregar as precauções de segurança que são apropriadas para os agentes biológicos que você está usando, levando em consideração o nível de biossegurança (s) da espécie. </li><li> Para evitar a contaminação de seu instrumento e as linhas de gás de transferência com agentes biológicos viável, instale filtros do tamanho dos poros adequados para a linha de gás transportador. Os filtros não irão interferir com a transferência de compostos voláteis da câmara de reacção SESI, mas pode ser ligeiramente o impacto da eficiência da transferência de aerosol. 6 </li><li> Use de contenção secundária ou um armário de biossegurança ao anexar a tampa de transferência de gás para o frasco de cultura para assegurar a contenção adequada em caso de derramamento de agentes biológicos. </li><li> Iniciar e terminar o fluxo de gás portador a sua garrafa de amostra de uma forma que não vai aumentar a pressão dentro da garrafa. </li></ol> 3. Otimização de instrumento NOTA: SESI-MS é projetado especificamente para voláteis da amostra, para limitar o uso da fragrância itens de cuidados pessoais (por exemplo, colônias, anti-séptico bucal, loções, amaciante de roupa), goma, cigarros, etc antes de usar o instrumento. Firmemente cap todos os produtos químicos voláteis no laboratório e de controle aéreo rascunhos, tanto quanto possível durante o teste. Os seguintes parâmetros instrumentais, que afetam a intensidade do sinal e estabilidade, terá de ser otimizado para o seu instrumento e experiência. <ol><li> Solução electrospray e taxa de fluxo: Escolha a solução electrospray apropriado para a classe de moléculas que deseja atingir, tendo em conta a polaridade instrumento operacional (modo positivo ou negativo-ion) e de caráter molecular dos compostos-alvo. Neste experimento a solução electrospray é de 0,1% de ácido fórmico, metanol 5,0%, 94,9% de água (v / v), o que aumenta a intensidade do sinal de menos moléculas polares while proporcionar estabilidade bom sinal. A solução é entregue a uma vazão de 5 nL / s. </li><li> Caudal do gás: O caudal do gás pode afetar a estabilidade electrospray e da intensidade do sinal. CO 2 (≥ 99,99%) a uma vazão de 2 L / min é usado aqui. </li><li> Forma de agulha e posição: A forma ea posição ponta da agulha afetar fortemente a intensidade do sinal e estabilidade. Ao instalar uma nova agulha, a posição da agulha deve ser otimizada para criar um equilíbrio entre o fundo baixo, alto sinal do analito, e estabilidade de sinal. A fim de reproduzir os espectros SESI depois de uma mudança de agulha, é necessário recolher periodicamente espectros como você ajustar a posição da agulha até que esteja capaz de igualar o espectro observado para seus registros. A distância da ponta da agulha electrospray à massa orifício especificação será 1-5 mm. </li><li> Tensão aplicada: A voltagem que é aplicada ao sistema afeta a intensidade de íons de sinal e da estabilidade do Taylor electrospray cone. Além disso, a tensão ideal é dependente de sua solução de electrospray e a forma da ponta da agulha. No início de sua série de experimentos, determine a tensão que produz o espectro ideal e estabilidade de sinal para o seu sistema, e depois usar essa voltagem para todos os experimentos subseqüentes. Para o nosso sistema, tensões aplicadas de 2,0-5,0 kV fornecer intensidade de sinal ótima e estabilidade electrospray. Para este experimento 2,5 kV é usado. </li></ol> 4. Ligar e ajustar o SESI-MS para análise <ol><li> Começar por assegurar que a tensão de alimentação está desligada e que o sistema é descarregado de eletricidade. Faça isso: 1) assegurar o indicador sobre a tensão de alimentação estão desligados, 2) garantir a tensão no multímetro é zero, e 3) de aterramento os fios elétricos. </li><li> Instalar a solução electrospray apropriado para a sua experiência. </li><li> Ligar o gás de arraste e definir o fluxo para a taxa apropriada para a sua experiência. </li><li> Aplicar pressão ao reservatório electrospray para iniciar a entrega da solução electrospray para a câmara de reação. </li><li> Ligue a tensão de alimentação e ajustar a tensão para um valor apropriado para seus experimentos. </li></ol> NOTA: Neste ponto, as superfícies de metal da fonte de ionização são capazes de entregar um choque perigoso. Ter um grande cuidado quando se trabalha em torno do instrumento uma vez que a tensão de alimentação foi ligado. <ol start="6"><li> Estabelecer um método de ajuste para o monitoramento do espectro SESI-MS ao fazer aperfeiçoá-lo ajustes para a tensão aplicada. Use os parâmetros de aquisição que tem otimizado para o seu sistema e sua experiência. Desmarque a vários canais de Aquisição caixa de seleção (MCA) (se aplicável) de modo que cada varredura produz um espectro independente, definir o tempo de aquisição de 10-15 min, e iniciar a aquisição. Espectros do fundo de gás transportador deve agora ser observados. </li><li> Faça aperfeiçoá-lo ajustes para a tensão aplicada para obter um cromatograma de íons estáveis ​​total (TIC) e verifica reprodutível que correspondem a CO 2 scans de suas experiências anteriores. Uma vez que os ajustes de tensão têm sido feitos, continuam a coletar espectros e TIC por cinco minutos para garantir o instrumento está estabilizado. </li><li> Uma vez que a estabilidade é assegurada instrumental, configurar o método de aquisição, conforme apropriado para as suas amostras, ajustando o tempo de aquisição, intervalo de dados e seleção de MCA, conforme necessário. Coletar uma transportadora de gás espectro de fundo para seus registros. </li></ol> 5. Obtenção de uma impressão digital volátil de sua cultura bacteriana <ol><li> Para coletar um espectro branco, direcionar o fluxo gasoso através das linhas de bypass, e em seguida, anexar a amostra em branco (válvulas fechadas) para as linhas de gás de transferência do instrumento. </li><li> Abra as válvulas para o frasco da amostra, e fechar as válvulas das linhas de bypass. </li><li> Permitir que o sistema atinja o equilíbrio por 30 segundos, durante os quais a umidade na câmara de reação está se estabilizando. Este período de equilíbrio é essencial para a obtenção de espectros reprodutível. Para garantir que o sistema está equilibrado, você pode querer monitorar o TIC, o que vai mudar durante o período de equilíbrio, e estabilizar depois. </li><li> Uma vez que o sistema é equilibrado, iniciar a coleta do espectro. </li><li> Depois que o espectro é coletado, retire o frasco da amostra pela primeira abertura do transportador linhas de desvio de gás, em seguida, fechar as válvulas de amostra e, finalmente, retirar o frasco da amostra. Lavar o sistema com o gás de transporte para 2-4 min, retirando a umidade e voláteis adsorvidos partir das linhas de transmissão, prevenção de amostra para amostra transição. </li><li> Repita os passos de 5,2-5,5 para cada amostra bacteriana, intermitentemente coleta de espectros em branco adicionais para garantir a completa subtração em branco. Incompleta subtração em branco levará àaparecimento de picos química de fundo no seu espectro processados ​​que são comuns às técnicas de ionização à pressão atmosférica (por exemplo, os ftalatos, silicones, etc.) 9 </li><li> Ao recolher o seu espectro, assegurar que os sinais de íons não são superiores aos limites de detecção linear de seu instrumento, como determinado pelo TIC ea intensidade máxima de picos individuais. Íons exceder os limites superiores do detector o seu instrumento pode gerar picos de artefato que não são representativos da sua amostra. </li></ol> 6. Resultados representante Como exemplo dos espectros SESI-MS que pode ser obtido para voláteis de bactérias, as impressões digitais íon positivo o modo volátil para E. coli e P. aeruginosa cresceu aerobicamente em Lennox-LB por 24 horas a 37 ° C são mostradas (Fig. 2). O E. coli volátil espectro é dominado por indole em 118 = m / z, o que dá E. culturas coli seu odor característico, enquanto que o espectro de P. aeruginosa contém uma maior variedade de picos protonatable. Por favor note que as intensidades relativas dos picos no espectro voláteis são dependentes dos parâmetros instrumental descrito na Seção 3. Esses parâmetros devem ser rigorosamente controladas a partir de experimento para experimento, a fim de obter espectros reprodutível. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 Blank-iões positivos subtraídos modo SESI-MS espectros (20 - 150 m / z). Da E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1 voláteis após 24 h de crescimento aeróbico em Lennox-LB a 37 ° C. Para mais detalhes sobre os picos observados nos espectros SESI, consulte Zhu, et al. 8.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Bactérias produzem diferentes combinações de compostos voláteis, que podem ser utilizados para identificação bacteriana 10-12 e avaliação do estado metabólico. O método SESI-MS descrito aqui fornece um meio de caracterizar rapidamente voláteis bacteriana (em dois minutos ou menos), sem qualquer preparação da amostra, gerando uma &quot;impressão digital&quot; bacteriana para a identificação da espécie. 8 Nas últimas décadas ionização a pressão atmosférica outros MS técnicas foram aplicadas para a caracterização de compostos voláteis, incluindo tubo de íon seletivo de fluxo (SIFT) e reação de prótons de transferência (PTR) espectrometria de massa. A vantagem distintiva que o SESI oferece mais esses métodos de ionização outro é que é possível a picos fragmento específico (desde que o tipo apropriado de espectrômetro de massa foi adaptada para o SESI), que é uma importante ferramenta para identificação de compostos. Nós não combater a fragmentação de pico no protocolo listados acima, mas exemplos de como informações de fragmentação pode ser utilizado na caracterização de compostos voláteis bacteriana, consulte Zhu, et al. 8 SESI-MS tem aplicação directa à situ na detecção de infecções bacterianas pulmonares através da análise da respiração, mas também pode ser aplicado a qualquer cenário em que a amostragem volátil é possível. Por exemplo, as análises de compostos voláteis na urina, sangue e respiração, que são relevantes para o diagnóstico de doenças metabólicas, doenças gastroenteric, câncer e exposição ambiental, estão bem adaptados ao SESI-MS. 13,14 SESI-MS também tem uma ampla gama de aplicações não clínicas fingerprinting VOC, incluindo a análise rápida de alimentos para os voláteis característica associada com o amadurecimento, o envelhecimento, ou estragar 15-18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> API-3000 Triplo Quadrupolo </td><td> Instrumento </td><td> SCIEX </td><td></td><td> Comprado com o Analista 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI Fonte Ion </td><td> Instrumento </td><td></td><td></td><td> Custom-made; referência Veja 6 </td></tr><tr><td> Medidor de fluxo de gás </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Gás carbônico </td><td> Equipamento </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99,99% puro </td></tr><tr><td> Nitrogênio </td><td> Equipamento </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Alta pureza Ultra </td></tr><tr><td> 100 mL de vidro de garrafas de mídia </td><td> Equipamento </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 roscas </td></tr><tr><td> Tampas de garrafa com portas luer </td><td> Equipamento </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Luer porta velas </td><td> Equipamento </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 009LP </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Tubo 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap montagem e linhas de transferência de gás </td></tr><tr><td> Tubo 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Duas válvulas de sentido </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Filtro, Grade AAQ </td><td> Equipamento </td><td> Filtros Balston </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico, LC / MS grau </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> A117-05AMP </td><td> Solução electrospray </td></tr><tr><td> Metanol, grau de LC / MS </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> A456-500 </td><td> Solução electrospray </td></tr><tr><td> Água, LC / MS grau </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> W6-500 </td><td> Solução electrospray </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) é um método desenvolvido para a rápida detecção de compostos voláteis, sem a necessidade de pré-tratamento da amostra. O método foi primeiramente descrita por Fenn e colaboradores 1 e tem sido aplicada para a detecção de drogas ilícitas 2 e explosivos 3-4, a caracterização de compostos voláteis de pele 5, ea análise de ar 6-7. SESI ionização ocorre por reações de transferência de prótons entre a solução eo analito electrospray volátil, e, portanto, adequado para a análise de hetero-moléculas orgânicas, assim como na ionização electrospray tradicionais (ESI). No entanto, ao contrário ESI padrão, o processo de transferência de prótons do SESI ocorre na fase vapor, em vez de em solução (Fig. 1), e, portanto, SESI é o mais adequado para a detecção de voláteis orgânicos e aerossóis. Estamos expandindo o uso do SESI-MS para a detecção de compostos voláteis de bactérias como um método para a identificação e caracterização de bactérias 8. Nós demonstramos que SESI-MS fingerprinting volátil, combinado com um método de análise estatística, pode ser usado para diferenciar gêneros de bactérias, espécies e culturas mistas em uma variedade de meios de crescimento. 8 Aqui nós fornecemos os passos para a obtenção de impressões digitais bacteriana voláteis usando SESI -MS, incluindo os parâmetros instrumentais que devem ser otimizados para garantir a identificação e caracterização de bactérias robusta.

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) permite a detecção de compostos orgânicos voláteis (VOCs) sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. Este protocolo fornece instruções para a caracterização (dentro de minutos) rápida de VOCs bacteriana usando SESI-MS.

Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K visualizações.  University of Vermont. Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) permite a detecção de compostos orgânicos voláteis (VOCs) sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. Este protocolo fornece instruções para a caracterização (dentro de minutos) rápida de VOCs bacteriana usando SESI-MS.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Bioengenharia

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Amostra Estratégias Preparação para Mass Spectrometry imagem da cultura celular 3D Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caracterização qualitativa da fração aquosa de Hydrothermal Liquefação de algas por cromatografia gasosa 2D com Time-of-flight Espectrometria de Massa

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...