Este estudo foi apoiado pelo Acordo de Cooperação Award AI075565 (a DAH) do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e pelo Fundo de Wendy e Ken Ruby for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC é a Judith e Robert Winston cadeira de Urologia Pediátrica.

1. Funcionalização de sensores eletroquímicos <ol><li> Prepare a sonda de captura tiolada a uma concentração de 0,05 mM em 300 mM de 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min . A incubação da sonda de captura tiolado com HDT garante que o grupo tiol na sonda de captura é reduzido, o que resulta em resultados mais consistentes. </li><li> Aplicar uma corrente de azoto a 16 de chip sensor array nua ouro (s) durante 5 segundos para remover a humidade e / ou partículas. </li><li> Aplicar 6 ul da mistura de sondas de captura de HDT-tiolado para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores da cortina de sensores e armazenar o chip sensor (es) numa placa de Petri cobertas a 4 ° C durante a noite. Sondas de captura tiolados ligar diretamente para o eletrodo de ouro nu eo HDT age para evitar excesso de embalagem das sondas de captura e mantê-los em uma conformação estendida que promove a hibridação com o alvo. </li><li> Oapós o dia, lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg. </li><li> Aplicar 6 ul de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incubar durante 50 min. Esta e todas as incubações subsequentes chips sensores são realizados numa caixa de Petri coberta, à temperatura ambiente. MCH actua como um agente de bloqueio, preenchendo todas as lacunas onde a sonda de captura tiolada ou HDT não está presente na superfície do eléctrodo. </li></ol> 2. Preparação da Amostra <ol><li> Transferir 1 ml de uma cultura bacteriana em fase logarítmica de crescimento (DO600 ≈ 0,1) a um tubo de microcentrifugação e centrifugar a 16000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante da cultura. A pelete bacteriana podem ser processados ​​imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso posterior. </li><li> Ressuspender cuidadosamente o sedimento bacteriano em 10 ul de NaOH 1 M aplicando a ponta da pipeta para o bottom do tubo de microcentrífuga e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar a suspensão à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Neutralizar o lisado bacteriano por adição de 50 ul de 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 2,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,25 mM de uma sonda detectora de fluoresceína modificado. Incubar o lisado neutralizado durante 10 min à temperatura ambiente. Detector de sondas Fluoresceína modificados hibridam com as moléculas-alvo rRNA bacteriano. </li></ol> 3. Sensor eletroquímico Assay <ol><li> Lavar o MCH a partir do chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg. </li><li> Aplicar 4 ul de ligado bacteriano neutralizada para o eléctrodo de trabalho de cada um dos sensores 14 e incubar durante 15 min. Complexos sonda-alvo detector de hibridizar imobilizadas sondas de captura tiolados. </li><li> Aplicar 4 pi de 1 nM de extrapolação oligonucleótido em 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 2,5% de BSA e 0,25 &amp;mu; M fluoresceína modificado sonda detectora de dois sensores de controlo positivo (utilizados para a normalização do sinal) e incubar durante 15 min. </li><li> Lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg. </li><li> Aplicar 4 ul de 0,5 U / mL de anti-fluoresceína-HRP em 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 0,5% de caseína para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incubar durante 15 min. O anti-fluoresceína-HRP liga-se às sondas imobilizadas detector fluoresceína modificados. </li><li> Lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg. </li><li> Aplicar uma camada bem adesivo na superfície do chip sensor e montagem de carga para o chip sensor. Pipetar 50 ml de substrato TMB em todos os 16 sensores e feche a montagem chip sensor. </li><li> Obter amperometria e medidas de voltametria cíclica para todos os 16 sensores usando o Helios Leitor Chip. Corrente amperométrica é proporcional à taxa de TMB redução na superfície do sensor (veja a Figura 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+(Zeptomole)+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification.">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li><li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform.">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).</li><li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples.">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li><li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification.">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens.">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li><li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature.">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens.">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection.">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li><li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms.">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li><li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples.">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li><li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibis+T5000:+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology.">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li><li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis.">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li></ol>

Todos os autores são inventores em patentes relevantes com os métodos descritos. Uma dessas patentes foi licenciada para Qvella Corporation. BMC e DAH tem participação acionária na Qvella Corporation. VG é o Presidente da GeneFluidics, que é a fabricante do chip matriz de sensores eletroquímicos, montagem de chip e leitor de chip descrito neste artigo.

O ensaio sensor electroquímico aqui descritos permite uma rápida detecção de alvos de ácido nucleico. Sensibilidade e especificidade dependerá em parte da energia livre de hibridização sonda-alvo, o que por sua vez depende do comprimento e do teor de GC de captura e as sondas de detecção. Normalmente, efectuar os passos de hibridação à temperatura ambiente (~ 20 ° C), 5, 6. No entanto, os passos de hibridação (3.2 e 3.3) também pode ser realizada a temperaturas elevadas num forno de hibridaç...

Usando rRNA como uma molécula alvo para a detecção e identificação de bactérias tem um número de vantagens. A abundância de rRNA em células bacterianas estabelece um limite de sensibilidade tão baixo como 250 bactérias por mililitro, sem a necessidade de amplificação de um alvo. RRNA bacteriano contém seqüências específicas de espécies únicas que são acessíveis a hibridização com sondas de DNA. Consequentemente, uma série de sensores electroquímicos podem ser usadas para identificar as bactérias desconhecidos, em que cada sensor é funcionalizada com uma sonda de captura específica da espécie diferente. Sensores de controlo positivo deve ser incluído para um alvo oligonucleotídeo sintético que &quot;pontes&quot; a captura e sondas de detecção para criar um sinal de calibração interno. Os sensores electroquímicos têm uma ampla gama de aplicações de pesquisa básica e translacional. Por exemplo, o ensaio aqui descrito foi usado para medir com precisão o efeito da E. coli em fase de crescimento RRNA e números de cópias pré-rRNA, que é de grande interesse para pesquisadores interessados ​​em fisiologia bacteriana 2. A sensibilidade do ensaio sensor electroquímico é determinado pela relação sinal-ruído. Uma variedade de métodos de amplificação de sinal e de redução do ruído ter sido explorado. Descobrimos que a melhoria da química da superfície do sensor é essencial para reduzir a ligação não específica da sonda detectora e / ou enzima HRP. Em particular, numa monocamada mista de alkanedithiols e mercaptohexanol foi encontrada para reduzir o fundo, cobrindo a superfície do eléctrodo de forma mais completa, mantendo a acessibilidade da sonda de captura para a hibridação alvo 3. Estes tratamentos químicos de superfície, são particularmente importantes para os ensaios em amostras biológicas complexas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-mercapto-1-hexanol (MCH)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>451088</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,6-hexanedithiol (HDT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H-12005</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thiolated capture probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein-modified detector probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bridging Oligonucleotide</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 426 346 910</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Helios Chip Reader</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-2009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor Chip Mount</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Film well sticker</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td></td>
 <td>Shipped with sensor chips</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bare gold 16-sensor array chips </td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>SC1000-16X-B </td>
 <td>Store in 100% N2 at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906 </td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M Phosphate Buffer, pH 7.2 </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocker Casein in PBS </td>
 <td>Pierce</td>
 <td>37528 </td>
 <td>Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Reagents and Equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors

Os sensores electroquímicos são amplamente usados ​​para a medição rápida e precisa da glucose sanguínea e pode ser adaptado para a detecção de uma ampla variedade de analitos. Sensores eletroquímicos operam por transdução de um evento de reconhecimento biológico em um sinal elétrico útil. A transdução do sinal ocorre por acoplamento a actividade de uma enzima de redox a um eléctrodo amperométrico. Especificidade do sensor ou é uma característica inerente da enzima, oxidase de glucose, no caso de um sensor de glicose, ou um produto de ligação entre a enzima e um anticorpo ou sonda. Aqui, descrevemos um método de ensaio sensor eletroquímico para detectar diretamente e identificar bactérias. Em todos os casos, as sondas aqui descritas são oligonucleótidos de ADN. Este método é baseado na hibridização sanduíche de captura e detector sondas com alvo ribossomal RNA (rRNA). A sonda de captura é ancorada à superfície do sensor, enquanto que a sonda é ligada ao detector de horseradish peroxidase (HRP). Quando um substrato, tal como 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) é adicionada a um eléctrodo com complexos de captura-alvo de detectores ligados à sua superfície, o substrato é oxidado por HRP e reduzido pelo eléctrodo de trabalho. Este ciclo redox resultados em vaivém de elétrons pelo substrato do eletrodo para HRP, produzindo o fluxo de corrente no eletrodo.

Descreve-se um doseamento electroquímico que é estruturado de forma semelhante a uma sanduíche de ELISA. Como mostrado na Figura 1, a hibridação de ARN alvo ribossomal (ARNr), com as sondas de captura e detector é desenvolvido por uma reacção redox catalisada por HRP conjugado com fragmentos de anticorpo anti-fluoresceína que se ligam à extremidade 3 &#39;de fluoresceína de ligação na sonda do detector. Um componente importante da sensibilidade do ensaio é a química da superfície do elé...

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

bacterial-detection-identification-using-electrochemical-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

28.1K visualizações.  Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System. Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperomét...