Os autores agradecem a Zoiray Technologies Inc., um parceiro co-patrocinador e comercialização, por seu apoio.

1. Preparação do substrato <ol><li> Revestimento em camadas de silício SiO 2 substratos com a auto-adsorção copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Síntese de copolímero, estrutura química e processo de revestimento são publicados em: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caracterização de um revestimento polimérico adsorvido para lâminas de vidro DNA Microarray. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> Brevemente, preparar solução de polímero por adição de 100 mg de polímero de 5 mL de água deionizada (DI) e adicionar 5 mL de sulfato de amônio 40% saturada ((NH 4) 2SO 4) solução para alcançar uma concentração final de 0,92 M. </li><li> Chips de submergir em solução por 30 min em um agitador e enxague bem com água DI. Seque bem com Argon / N 2 de gás. </li><li> Fichas leve ao forno a 80 ° C por 15 min. </li></ol></li><li> Loja de polímero revestido substratos / fichas em um ambiente seco (exsicador de vácuo) para até 3 meses até sonda spotting procedimento. </li></ol> 2. Preparação de Probe Array: Anticorpos antígenos, ss / dsDNA, RNA, etc <ol><li> Diluir sonda (s) para concentração adequada em tampão desejado. Este passo pode ser muito variável, mas uma experiência típica utiliza antígeno ou IgG em uma concentração de 0,5 mg / mL (faixa de 0,1 -1 mg / mL) em tampão fosfato salino (PBS), pH ≈ 7,4. </li><li> Coloque soluções em um 96 - ou 384 bem-chapa (ou placa de fonte padrão para o observador a ser utilizado) </li><li> Configuração de parâmetros para spotting desejado série impresso: determinar os parâmetros adequados para manchar a superfície e as soluções a ser utilizado (tempos de parada, velocidades de aproximação, etc.) Determinar o número de repetições de cada condição por grade, o layout de grade, o número de grades de replicar, e no local desejado spotting no chip. Substratos lugar e placa de fonte nos locais apropriados, certifique-se garrafas de resíduos e abastecimento estão prontas, e começar a executar a impressão. </li><li> Depois de spotting é terminar substratos lugar em um ambiente de alta umidade durante a noite (4-18 horas) para permitir processo de imobilização e desativação para prosseguir. </li><li> Lavar substratos: colocá-los nas seguintes soluções durante três minutos para três lavagens separadas: PBS com Tween 0,1% (PBST), PBS e, finalmente, água deionizada (DI). Dependendo do tipo de experimento (wet vs seco), seca o chip completamente com gás argônio e começar a incubação ou colocar o chip em uma câmara de fluxo e montar. </li><li> Desativar demais grupos NHS na superfície copolímero submergindo as fichas em uma solução de 50 mM de etanolamina com o pH ajustado para 7,4 por 30 minutos, enquanto em uma placa de shaker. Um composto contendo aminas primárias, como hidroxilamina ou Tris também pode ser usado, desde a solução preparada é seguro para uso com proteínas. Lavar cuidadosamente a solução desativação usando PBS, em seguida, água DI. </li><li> Passo opcional (dependendo da química de superfície sendo empregados): Bloco de superfície usando uma solução de BSA, caseína, leite ou reidratado durante 30 minutos. Para a química da superfície de polímero atual que usamos, nós não realizar esta etapa como a espinha dorsal de polímeros para evitar que atos não-específica ligação às proteínas. </li></ol> 3. Dados Procedimento de Aquisição e Incubação: formato Endpoint <ol><li> Faça uma solução do alvo de interesse no buffer desejado. Aqui, será uma solução de concentração adequada de Anti-BSA em PBS (ex: make mL 10/01 de uma ng 10 / mL de solução anti-BSA em PBS). Além disso, certifique-se de ter uma quantidade equivalente de tampão (sem destino) para a incubação de controle negativo. </li><li> Dê uma varredura espelho de silício para normalizar todos os dados recolhidos posteriormente. </li><li> Varredura da matriz sonda preparada com o sistema IRIS antes da etapa de incubação para determinar a altura inicial óptico (massa) em cada ponto. Isto irá permitir a análise adequada das alterações na massa na superfície, ou seja, o nível de vinculação, após a incubação. Aqui, alguns parâmetros serão ajustados para o experimento atual, como tempo de exposição, campo de visão, concentrando-se prosperando, etc </li><li> Chip de submergir (s) em solução preparada para uma hora em uma placa de shaker. O período de incubação pode variar consideravelmente, dependendo do nível de agitação, a concentração de alvo a ser detectado, as características de transporte da câmara de fluxo (se um modo de detecção em tempo real está sendo usado), as afinidades do par-alvo de sondagem, etc . </li><li> Após a incubação, repita o procedimento de lavagem descrito no passo 2.5) </li><li> Digitalização a matriz mesma sonda usando o sistema IRIS e obter pós-incubação imagens para pré-incubação de comparação. </li><li> Repita esse processo para as etapas de incubação diferente, se necessário, por exemplo, em um formato de ensaio sanduíche onde um anticorpo secundário está sendo usado. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Se encaixam as imagens coletadas para cada scan IRIS (seqüência de imagens de intensidade), utilizando o software desenvolvido para lab-produzir uma imagem da sonda a matriz contendo informações espessura óptica. Uma rápida análise qualitativa de ligação pode ser feita subtraindo (registrados) e pós-pré-incubação imagens. Ligação aparecerá como uma mudança na intensidade naqueles pontos onde as mudanças de massa foram observados. Para a análise quantitativa, determinar as densidades de massa de cada ponto em relação ao fundo pela média informações espessura óptica para cada pixel dentro de um local e um anel fora do local e fazer uma comparação direta entre estas duas áreas. </li></ol> 5. Resultados representativos: A Figura 1 mostra um exemplo do esquema em camadas Si-SiO substrato IRIS 2 manchado com uma matriz de anticorpos representante. Cada conjunto de anticorpos é visto em replicar com especificidade para um epítopo diferente direcionamento proteínas diferentes. Dois diferentes vírus inteiros e uma proteína viral são representados como alvos exemplo. Anticorpos controle negativo depende do ensaio e pode ser não-específica e / ou vírus específico. A Figura 2 mostra a ligação de albumina sérica humana (HSA) com anticorpos monoclonais específicos para uma matriz de spotted HSA e IgG de coelho (controle) pontos. Como pode ser visto aqui, após a montagem e determinação da espessura óptica para as imagens pré e pós-incubação, uma imagem de diferença para a matriz de ligação pode ser criado para avaliar qualitativamente vinculativo. Análise quantitativa revela que um 2,05 e 0,13 nanômetros significa alterar a altura óptico foi observado para o HSA e spots de coelho IgG, respectivamente, para uma concentração de incubação anti-HSA de 500 ng / mL. A Figura 3 mostra uma medida de dependência IRIS Fur ligação às proteínas sobre a concentração de proteína e comprimento oligômero dsDNA. O gráfico de cima mostra absoluta medidas de altura ópticos para alturas inicial oligômero imobilizado sonda e pós-incubação de ligação Fur. Concentrações crescentes de pele (50, 100, 200 nM) resultou na ligação aumentada para sondas de DNA. O comprimento dos oligômeros também impactos vinculativo Fur com seqüências mais longas, resultando em mais vinculativo. Aqui, barras de erro representam um desvio-padrão da média. O enredo inferior mostra dímero de proteínas calculado Fur ligação por fio dsDNA. Dimer ligação foi significativamente maior na concentração de proteína Fur de 200 nM sugerindo um alto nível de ligação não específica. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquemática de um array sonda exemplo, normalmente utilizado em um experimento para detectar vírus e componentes específicos viral de forma multiplexada com o sistema IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Pós-incubação imagem diferença para a ligação de albumina de soro humano de anticorpos específicos para manchado HSA coletados com este sistema de rótulo livre na concentração de 500 ng / mL. A densidade de massa biomaterial para cada ponto é determinado pela média de espessura óptica informações dentro de um local e depois comparar com a média de um anel em torno do ponto que representa o fundo. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Lote de ligação de dados para as interações Fur proteína com spotted double-stranded oligômeros com uma seqüência consenso conhecido com base no comprimento de oligômero, localização da seqüência de consenso no âmbito do oligômero, ea concentração de proteínas da pele. Informações sobre a quantidade absoluta de proteína Fur obrigado a cada seqüência manchado (em cima) pode ser usado para estimar o número de dímeros Fur vinculados a cada tipo de oligômero (baixo).

<ol>
	<li>&#214;zkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications.">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li><li>&#214;zkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches.">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li><li>&#214;zkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed,+high-throughput,+label-free,+and+dynamic+biosensing+platform.">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li><li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., &#214;zkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging.">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A plataforma IRIS é um sistema simples e rápido de usar para a recolha de high-throughput de ligação de dados em um formato de microarray. Por imobilizar covalentemente diferentes sondas funcionais de proteínas ou DNA em uma superfície antígenos alvo / biomarcadores / etc. podem ser capturados a partir de solução, como em um imunoensaio. Medição dessas interações entre as condições sonda em um terminal ou em tempo real formato com o sistema IRIS permite que a informação altamente sensível e quantitativos a serem coletados para cada interação. O experimento representante detalhado aqui é apenas um exemplo dos tipos de interações que podem ser estudados com esta técnica. Detecção de fatores de transcrição, os antígenos virais, vírus e todo tem sido demonstrado anteriormente e representa apenas alguns exemplos dos tipos de análises que o IRIS pode facilmente manipular.

<ol><li> Wafers de silício com 500 nm de dióxido de silício termicamente crescido, Silicon Valley Microelectronics, ordem personalizada <li> Pó de sulfato de amônio, Sigma-Aldrich gato. # A5132 <li> Tampão fosfato salino (PBS) concentrado 10X pronto, Fisher Scientific gato. # BP665-1 <li> Anticorpos para albumina sérica humana (Anti-HSA), Sigma-Aldrich gato. # A0433 <li> Albumina sérica humana (HSA), gato Sigma-Aldrich. # A9511 <li> Argônio ou nitrogênio gás (ultra-alta pureza), gato Airgas. # AR UHP300 ou # NI UHP300 <li> Placas de Petri, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific gato. # 0875713A <li> Scienceware ® vácuo dessecador, Sigma-Aldrich gato. # Z119016 <li> Tubos de microcentrífuga, Fisher Scientific gato. # 05-408-120 <li> Placas de 96 poços, a ligação célula baixa, Nalgene Nunc gato International. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Etanolamina, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hidroxilamina, Thermo Scientific gato. # 26103 <li> Multi-purpose rotador, Thermo Scientific (Barnstead International), modelo # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga câmera 2000R, gato QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> Fonte de iluminação AcuLED, PerkinElmer, ordem personalizada <li> Componentes ópticos (lentes, objetivos, aberturas, grades, postes, etc), Thorlabs </ol>

biomolecular detection employing the interferometric reflectance imaging sensor (iris)

A medição sensíveis de interações biomoleculares tem uso em muitos campos e indústrias como a biologia básica e microbiologia, monitoramento ambiental / agrícola / biodefesa, nanobiotecnologia, e muito mais. Para aplicações de diagnóstico, monitoramento (detectar) a presença, ausência, ou a expressão anormal de biomarcadores de proteômica alvo ou genômico encontrado em amostras de pacientes pode ser usado para determinar abordagens de tratamento ou eficácia terapêutica. Na área da pesquisa, a informação sobre afinidades e especificidades molecular são úteis para a plena caracterização dos sistemas sob investigação. Muitos dos sistemas atuais empregados para determinar as concentrações moleculares ou afinidades contam com o uso de etiquetas. Exemplos desses sistemas incluem imunoensaios tais como o ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase (PCR), ensaios de eletroforese em gel e espectrometria de massa (MS). Geralmente, esses rótulos são fluorescentes, radiológicas, ou colorimétrico na natureza e estão directa ou indirectamente ligados ao alvo molecular de interesse. Embora o uso de etiquetas é amplamente aceito e tem algumas vantagens, há desvantagens que estão estimulando o desenvolvimento de novas rótulo sem métodos para medir essas interações. Estas desvantagens incluem aspectos práticos, tais como o custo aumentou ensaio, reagentes vida e as preocupações de armazenamento, usabilidade e segurança, desperdício de tempo e esforço na rotulagem, ea variabilidade entre os reagentes diferentes devido aos processos de rotulagem ou rótulos próprios. Em uma base de pesquisa científica, o uso desses rótulos também pode introduzir dificuldades, tais como preocupações com os efeitos sobre a funcionalidade de proteínas / estrutura devido à presença dos rótulos anexados ea incapacidade de medir diretamente as interações em tempo real. Aqui apresentada é a utilização de um biosensor rótulo sem nova ótica que é passível de microarray estudos, denominado o Imaging Sensor Interferometric Reflectância (IRIS), para detecção de proteínas, DNA, material antigênico, patógenos todo (virions) e outro material biológico. O sistema IRIS tem sido demonstrado ter alta sensibilidade, precisão e reprodutibilidade de interações biomoleculares diferentes [1-3]. Benefícios incluem a capacidade multiplex de imagem, em tempo real e capacidades de medição endpoint, e outros de alto rendimento atributos, tais como consumo de reagente, bem como diminuição nos tempos de ensaio. Além disso, a plataforma IRIS é simples de usar, requer equipamento barato, e utiliza silício baseados em componentes do ensaio em fase sólida tornando-o compatível com muitas abordagens contemporâneas de química de superfície. Aqui, apresentamos o uso do sistema IRIS, desde a preparação de matrizes de sonda para incubação e medição de meta vinculativa para a análise dos resultados em formato de ponto de extremidade. O sistema modelo será a captura de anticorpos alvo, que são específicas para albumina sérica humana (HSA), em HSA-spotted substratos.

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Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Superfícies pode ser conseguido usando uma técnica simples interferométricos que depende de iluminação LED, o mínimo de componentes ópticos, e uma câmera. O sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS) é barato, simples de usar, e passíveis de microarray formatos.

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

14.5K visualizações.  Boston University. Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em SiO 2 Superfícies pode ser conseguido usando uma técnica simples interferométricos que depende de iluminação LED, o mínimo de componentes ópticos, e uma câmera. O sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS) é barato, simples de usar, e passíveis de microarray formatos.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

Projeto e fabricação de uma Unidade de elastômero para robôs modulares moles em Cirurgia Minimamente Invasiva

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Síntese orientada por microondas de óxido de ferro nanopartículas para detecção rápida de Aterosclerose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

Expressão independente de metanol por Pichia Pastoris , empregando tecnologias de repressão

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Avaliação de comportamentos fotossintéticos por medições simultâneas de reflectância foliar e análises de fluorescência de clorofila

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...