Agradecemos a Rebecca Nishi, MS, e os técnicos da Fundação Christopher Reeve &amp; Dana Facility Núcleo Animal na UC Irvine por sua ajuda na cirurgia animal. Agradecemos também a Gabriella Funes, Usha Nekanti e Denisse Moreno por técnicos preparados manuscrito, assistência e gravar vídeo e animação. Esta pesquisa foi suportada pelo NINDS (RO1 NS43428-01 a AJA), o Projeto de Paralisia da América (PPA-32574 para HXN), e do Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) Stem Award Treinamento Celular T1-00008 para HXN. KDB foi apoiado pelo programa de formação em neurociência molecular e celular na UC Irvine (T32 NS007444).

1. Dissociação do tecido da medula espinhal <ol><li> Segmentos da medula espinhal T8-T10 de não acidentados ou da medula espinhal feridos contusão (lesão no T9) ratos Sprague Dawley foram dissecados e mecanicamente dissociada com uma tesoura bem em HBSS à temperatura ambiente, como descrito anteriormente 1. Antes de tecido dissociação, toda colunas medula espinhal foram mantidos em gelo seco por 5 minutos antes da extração de segmentos de cabo de T8-T10. </li><li> Pedaços de tecido foram recuperadas por centrifugação (1 minuto, 1000 rpm, temperatura ambiente) e enzimaticamente dissociado com 2,5 mg de tripsina e 5 colagenase mg em 5 ml DME (Media Modified Dulbecco Eagle) por 20 minutos a 37 ° C antes de trituração (~ 10 vezes à temperatura ambiente) com uma pipeta Pasteur de vidro (9 polegadas). </li><li> 10 ml de DME + 10% de soro fetal bovino foi adicionado às células para inibir a atividade enzimática e, em seguida, foi filtrada através de um filtro de células 40 mM. Depois de um giro rápido, o pellet celular foi ressuspendido em 6 ml de HBSS e sobrepostos em soluções OptiPrep gradiente descrito abaixo. </li></ol> 2. Criando OptiPrep gradiente soluções <ol><li> OptiPrep diluída foi construída diluindo OptiPrep 1:1 com MOPS Tampão (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7.4). </li><li> Quatro soluções OptiPrep gradiente foram feitos através da mistura de 350, 250, 200, ou 150 mL OptiPrep diluído com HBSS a um volume final de 1 ml (Tabela 1). </li><li> As quatro soluções foram lenta e cuidadosamente colocados em camadas em um tubo de 15 ml cônico com menos diluída na parte inferior e mais diluída no topo (Figura 1A). </li></ol> 3. Separar lipídicas / mielina restos de células <ol><li> 6 ml de células dissociadas espinhal em HBSS foi cuidadosamente em camadas em cima das soluções gradiente OptiPrep. </li><li> Tubo contendo células e soluções gradiente foi centrifugado (15 minutos, 1900 rpm ou 726 RCF, 20 ° C), utilizando uma centrífuga Eppendorf 5810R com um rotor basculante (A-4-62), separando a solução de células em camadas distintas com lipídios / mielina detritos (top 7 ml do tubo), seguido por três camadas de neurônios, com células inflamatórias, células gliais, e os glóbulos vermelhos no pellet. Embora a maioria das células inflamatórias, como monócitos, macrófagos, granulócitos PMN e linfócitos foram encontrados no sedimento, algumas de grande porte macrófagos ativados podem ser encontradas em camadas acima do sedimento. </li><li> A camada de detritos lipídicas / mielina (top 7 ml) foi cuidadosamente aspirado e removido. As células foram então lavadas e ressuspendidas em 2,5 ml HBSS e usado para imunomarcação abaixo. </li></ol> 4. Imunomarcação de células imunes específicas para citometria de fluxo <ol><li> Células (500 mL) coletados de preparações da medula espinhal foram peletizadas e ressuspendidas em solução de cloreto de amônio 0,85% (diluído em água destilada) por 5 minutos para lisar as células vermelhas do sangue. </li><li> Células foram lavadas com 500 mL HBSS e depois bloqueado por 30 minutos em coelhos normais ou soro do mouse em temperatura ambiente. </li><li> Células foram lavadas e incubadas em temperatura ambiente por uma hora com o anticorpo (Rabbit anti-PMN FITC, Chemical precisa e científica; Rato anti-rato ED1 Alexa 488, Serotec, ou rato de rato anti-CD3 Alexa 488) ou solução isotipo IgG diluído em HBSS (todos na diluição 1:100), como descrito anteriormente 1. </li><li> Células foram lavadas duas vezes depois de cada passo acima e então ressuspendido em 300 mL HBSS após a etapa final. </li></ol> 5. Avaliação quantitativa de células por citometria de fluxo <ol><li> As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton-Dickinson), utilizando software da Quest Cell. 5.000 eventos por amostra foram lidas para todas as amostras e análise de dados foi concluída com a Summit (DakoCytomation). </li><li> Portões de citometria de fluxo foram definidos usando células controle isotipo IgG rotulados ou células da medula espinhal de animais controle ileso para definir valores de referência para a normalização em momentos como descrito anteriormente 1. Os valores médios de células positivamente marcadas foram expressas como percentagem (± SEM) de toda a amostra. </li></ol> 6. Resultados representativos: A capacidade de um gradiente OptiPrep para remover restos de mielina e melhorar a detecção de células imunes por citometria de fluxo foi avaliada através da quantificação PMNs espinhal em 1 dpi (Figura 1B), o pico anteriormente relatados de infiltração PMN após SCI 1-3. Alternativamente, identicamente dissecados medulas espinhais foram enzimaticamente dissociado sem OptiPrep remoção de detritos de mielina e foram igualmente avaliados em paralelo para a infiltração PMN por citometria de fluxo. Como já relatado anteriormente 1, houve uma mudança na posição de eventos em amostras isoladas com OptiPrep método de purificação em relação ao gradiente de dissociação enzimática sozinho, demonstrando o percentual de PMNs detectados em amostras com resíduos de mielina intacta era apenas uma fração (0,5%) do percentual de PMN detectado (5,1%) em OptiPrep Purified amostras (Figura 1B). Estes dados sugerem que os restos de mielina em preparações de tecido pode obscurecer leituras de citometria de fluxo, e demonstrar que a remoção dos restos de mielina aumenta a sensibilidade de detecção de células imunes no tecido medula lesionada. Tendo estabelecido a sensibilidade do sistema de gradiente OptiPrep para a detecção de células na medula lesionada, que caracteriza-se mudanças na infiltração celular ao longo de um período que varia de 2 horas a 180 dpi e estabeleceu uma resposta multifásica romance de inflamação celular após a LM, que incluiu PMN, macrófagos / microglia e células-T. Tal como confirmado por estudos anteriores 1-3, PMN entrou pela primeira vez o cabo de 2 horas pós-lesão e atingiu um máximo de 1 dpi (Figura 2 e 4). Macrófagos / microglia por outro lado, 1,4,5, não foram detectadas na medula lesionada até 3 dpi, e chegou inicialmente em sete dpi (Figura 3 e 4). Surpreendentemente, nós mostramos pela primeira vez que os macrófagos / microglia atingiu pela segunda vez a 60 dpi e permaneceu elevada por 180 dpi (Figura 3 e 4). Similar aos macrófagos / microglia, infiltração de células T foi previsto para o pico 05-07 julho dpi, no entanto, citometria de fluxo não detectou qualquer mudança no número de células T nos primeiros 7 dpi, embora um elevado número de células T foi detectada às 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Enquanto T-cell número foi diminuindo em 10 dpi, uma resposta de células T persistente foi observada em 180 dpi, momento em que 4,4% de células foram marcadas para CD3 (Figura 4). Juntos, estes dados demonstram uma resposta dependente do tempo multifásica de inflamação celular após SCI (Figura 4); as fases iniciais de inflamação celular eram compostas do pico precoce de PMNs 1 dpi seguido de um pico de ED1 + macrófagos / microglia 7 dpi e T células-9 dpi, enquanto as fases posteriores eram compostas de três populações celulares subindo depois de 14 dpi e persistindo em 180 dpi, com um pico notável segundo de macrófagos / microglia em 60 dpi. Este estudo timecourse e os dados quantitativos gerados por citometria de fluxo foram validados anteriormente, mostrando resultados comparáveis ​​aos dados coletados de estereologia quantitativa de immunolabeled seções da medula espinhal 1. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="Tabela 1"/> Tabela 1. Preparação de OptiPrep gradiente para a remoção dos restos mielínicos. Quatro soluções gradiente OptiPrep são feitas com HBSS e OptiPrep diluída (1:1 diluição de OptiPrep e MOPS). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Densidades de gradiente OptiPrep mais separados mielina / restos de feridos da medula espinhal tecidos / células e melhorar a avaliação de célula imunológica por citometria de fluxo. (A) A mielina / detritos foi separado a partir de células (neurônios, células gliais e células do sistema imunológico) após a centrifugação do tecido da medula espinhal através dissociada um gradiente OptiPrep seguida de aspiração de mielina / detritos camada. (B) Número de PMN na medula lesionada, mostrando uma maior sensibilidade na detecção de PMNs após a remoção de detritos (Student t-test, p = 0,0001). Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso; n = 5 por grupo, média ± SEM. 5.000 eventos por amostra foram lidas para todas as amostras e os valores médios de células positivamente marcadas foram expressas como percentagem (± SEM) de toda a amostra. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Detecção de infiltração PMN na medula lesionada por citometria de fluxo. Depois de uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9, PMNs rapidamente entrou na medula espinhal a partir de 2 horas (B) pós-lesão e pico 1 dpi (C). Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso (A). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Detecção de macrófagos / microglia infiltração na medula lesionada por citometria de fluxo. Depois de uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9, ED1 + número de macrófagos / microglia aumento na medula lesionada a partir de 3 dpi (D), atingiu o pico de forma aguda em 7 dpi (E), caiu para níveis baixos em 14 dpi (F) , antes de subir para um segundo pico em 60 dpi (G), e permaneceu na medula lesionada até 180 dpi (H). IgG rotulagem controle de isotipo de 7 dpi células da coluna (B) mostrou fundo anticorpo rotulagem mínimas e nenhuma diferença para as células-anticorpo rotulado de 2 horas pós-lesão (C) ou não lesionado (A) animais. Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="Tabela 2"/> Tabela 2. Amostras de animais em experimentos timecourse. Para cada ponto de tempo (0 hr a 180 dpi), cinco animais receberam uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9,e tecidos da medula espinhal foram avaliadas por citometria de fluxo para o número de PMNs, ED1 + macrófagos / microglia e CD3 + T-cells. No entanto, nem todas as amostras de animais foram recuperados com sucesso para o PMN (4-5), ED1 (3-5), e CD3 (4-5) por citometria de fluxo análises. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A timecourse de inflamação celular na medula espinhal após uma lesão contusão moderada (200 kd) em T9. Avaliada por citometria de fluxo, o número de PMNs, ED1 + macrófagos / microglia e CD3 + T-cells pico de forma aguda (1,7 e 9 dpi, respectivamente) e persistiu cronicamente na medula lesionada. N = 3 a 5 por grupo, média ± SEM.

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	<li>Beck, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cellular+inflammation+after+traumatic+spinal+cord+injury:+evidence+for+a+multiphasic+inflammatory+response+in+the+acute+to+chronic+environment.">Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.</a> Brain. 133, 433-447 (2010).</li><li>Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. 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G., Wei, P., Stokes, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+inflammatory+response+after+spinal+cord+injury+in+Sprague-Dawley+and+Lewis+rats.">Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats.</a> J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).</li><li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+hematogenous+macrophages+promotes+partial+hindlimb+recovery+and+neuroanatomical+repair+after+experimental+spinal+cord+injury.">Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).</li><li>Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+quantitative+analysis+of+spinal+cord+cells+from+Theiler's+virus-infected+mice+without+the+requirement+for+myelin+debris+removal.">Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal.</a> J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).</li><li>Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+CD41-labeled+platelets+isolated+by+the+rapid,+one-step+OptiPrep+method+from+human+blood.">Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood.</a> Cytometry A. 65, 84-87 (2005).</li><li>Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+adult+rat+hippocampal+neurons+with+long-interval+changing+media.">Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media.</a> Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).</li><li>Tjoa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+flow+cytometry+to+assess+neutrophil+infiltration+in+the+injured+murine+spinal+cord.">The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).</li><li>Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+inflammation+decreases+secondary+degeneration+and+functional+deficit+after+spinal+cord+injury.">Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).</li><li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry.">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O uso da citometria de fluxo para quantificar células do sistema imunológico no SNC é complicada por lipídicas / mielina conteúdo e detritos. Além de interferir com a ligação de anticorpos e especificidade, os restos de mielina pode ter tamanho similar e as propriedades de granulação com células do sistema imunológico, diminuindo a sensibilidade de medição e precisão 8. O romance método de preparação de células aqui descrito é eficaz na remoção de detritos de mielina e, assim, melhora a sensibilidade da citometria de fluxo para detectar mudanças na inflamação celular na medula lesionada. Por exemplo, a remoção dos restos mielínicos por este método de detecção aprimorada de células imunes em comparação com dissociação enzimática alone.Critically, o uso romance deste método permitiu a caracterização da primeira aguda e crônica a inflamação celular após a LM para incluir um curso de tempo completo para PMNs, macrófagos / microglia e células-T até 180 dpi, e identificou uma fase de segundo romance de inflamação celular. Esses importantes achados de um componente de neuroinflamação multifásica pode ser crucial para a concepção e implementação de estratégias racionais de tratamento terapêutico, incluindo intervenções ambos baseados em células e farmacológicas para o SCI. O sistema de gradiente OptiPrep tem sido usado para separar os restos de células no sangue 9, ou neurônios purificar a partir do cérebro para fins de cultura de células 10, no entanto, temos modificado e avançado método este sistema para separar os restos de mielina das células da medula espinhal dissociados, e permitiu quantificação rápida e mais precisas de inflamação celular por citometria de fluxo. Este método, juntamente com a citometria de fluxo é susceptível de proporcionar avanços significativos na pesquisa inflamação após CNS lesões ou condições patológicas, como a maioria dos estudos apenas caracteriza a inflamação celular no SNC através de técnicas morfológicas e histológicas que não são células de tipo específico ou não pode sempre fornecer informações verdadeiras avaliação quantitativa. Além disso, alguns estudos recentes têm tentado quantificar as células imunológicas na medula lesionada por citometria de fluxo utilizando tecido da medula fresco dissociada 11,12 ou células separadas por gradiente de Percoll sistema de 13, no entanto, esses estudos têm demonstrado tanto colheitas de células de baixa ou insensível detecção de células do sistema imunológico. Em contraste, o gradiente OptiPrep método de preparação de células forneceu, pela primeira vez, sensível e confiável de avaliação quantitativa por citometria de fluxo para mudanças de inflamação celular em resposta à gravidade da lesão classificados e mais de uma timecourse estendida até 180 dpi. A sensibilidade ea confiabilidade da análise de citometria de fluxo também dependem da especificidade dos anticorpos usados ​​para detectar tipos específicos de células imunes, como a citometria de fluxo não permite critérios morfológicos para distinguir ainda mais tipos de células. A especificidade de anticorpos para PMNs, macrófagos / microglia ou T-conta tem sido testado exaustivamente em citometria de fluxo para PMNs peritoneal e nos macrófagos alveolares em cultura e as células do tecido da medula espinhal 1,2 feridos. Juntamente com o sistema de gradiente OptiPrep, esses anticorpos usados ​​para citometria de fluxo têm contribuído para a geração de uma análise temporal e quantitativa da inflamação celular que tem proporcionado uma nova visão sobre a dinâmica do microambiente SCI, e identificado pela primeira vez uma resposta estendida multifásica de inflamação celular. Esta resposta multifásica de células após a LM pode ser importante para investigar o papel de tipos específicos de células presentes em momentos específicos após a lesão ou gerar intervenções terapêuticas contra tipos específicos de células que podem agravar os ferimentos. Além disso, estes resultados podem ajudar no desenvolvimento de um raciocínio apropriado para as intervenções ideal drogas ou baseados em células de SCI.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> Coelho anti-rato PMN (FITC) </td><td> Chemical precisas e Científico </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> Rato anti-rato ED1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> Rato rato anti-CD3 (FITC) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> Sigma </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Soro de coelho </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> Rato de soro </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> Filtro celular </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

Detecção de células imunológicas no sistema central feridos nervoso central (SNC), utilizando técnicas morfológicas ou histológicas não forneceu sempre verdadeira análise quantitativa de inflamação celular. Citometria de fluxo é um método rápido alternativa para quantificar as células imunológicas no cérebro lesionado ou tecido da medula espinhal. Historicamente, a citometria de fluxo tem sido utilizada para quantificar células do sistema imunológico coletadas do sangue ou do baço ou timo dissociados, e poucos estudos têm tentado quantificar as células imunológicas na medula lesionada por citometria de fluxo utilizando tecido da medula fresco dissociados. No entanto, o tecido da medula espinhal é dissociada concentrado com os restos de mielina que podem ser confundidos com as células e reduzir a confiabilidade da contagem de células obtidas pelo citômetro de fluxo. Temos avançado um método de preparação de células usando o sistema de gradiente OptiPrep efetivamente detritos lipídicas / mielina em separado a partir de células, proporcionando quantificações sensível e confiável de inflamação celular na medula lesionada por citometria de fluxo. Como descrito em nosso estudo recente (Beck &amp; Nguyen et al, Brain 2010 Fev; 133 (Pt 2):.. 433-47), a preparação celular OptiPrep tinha aumentado a sensibilidade para detectar a inflamação celular na medula lesionada, com contagens de tipos específicos de células correlacionando com a gravidade da lesão. Criticamente, o uso deste método romance desde a primeira caracterização da inflamação aguda e crônica celular após SCI para incluir um curso de tempo completo para leucócitos polimorfonucleares (PMNs, neutrófilos), macrófagos / microglia e células T ao longo de um período que varia de 2 horas para 180 dias pós-lesão (dpi), a identificação de uma fase de romance surpreendente segundo de inflamação celular. Caracterização completa da inflamação celular usando este método pode fornecer uma melhor compreensão da neuroinflamação no SNC feridos, e revelam um componente importante de neuroinflamação multifásica que pode ser crítica para a concepção e implementação de estratégias racionais de tratamento terapêutico, incluindo tanto baseados em células e farmacológicas intervenções para a SCI.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Quantificação da inflamação celular no SNC feridos / patológica por citometria de fluxo é complicada por lipídicas / mielina detritos que podem ter tamanho similar e granulação para as células, diminuindo a sensibilidade / precisão. Temos avançado um método de preparação de células para remover restos de mielina e melhorar a detecção de células por citometria de fluxo na medula lesionada.

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K visualizações.  University of California. Quantificação da inflamação celular no SNC feridos / patológica por citometria de fluxo é complicada por lipídicas / mielina detritos que podem ter tamanho similar e granulação para as células, diminuindo a sensibilidade / precisão. Temos avançado um método de preparação de células para remover restos de mielina e melhorar a detecção de células por citometria de fluxo na medula lesionada.

Vídeo: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...