Os autores gostariam de agradecer as fontes de financiamento: Exército-UNL Centro de Mecânica Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Chandra Namas), Prêmio Layman UNL (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

1. Cultura Celular Neuronal <ol><li> As células do cérebro, incluindo células neuronais, astrócitos e a sua co-cultura pode ser utilizado como um modelo de célula. Como uma demonstração de viabilidade, pressurização impulsivo de células da linha de células neuronais é apresentado. </li><li> SH-Sy5y células de neuroblastoma humano (ATCC, CRL-2266) são cultivadas em lamelas de vidro 18 mm de diâmetro. As células são semeadas a uma densidade de 3 x 10 3 células / cm 2, usando os meios de crescimento composto por DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Lâminas de vidro de células em cultura são mantidas em 5% de CO 2 incubador humidificado a 37 ° C. </li><li> Para obter a diferenciação de células neuronais de células SH-Sy5y, as células são tratadas com meio suplementado com mais de 10 uM de ácido retinóico (AR) durante 7 dias com meio mudado a cada dois dias. No dia 7, as células estão prontas para ser pressurizado. </li></ol> 2. Equipamento de pressurização: Kolsky Bar <ol><li> A barra de Kolsky, dedesenvolvido pela Kolsky 1 em 1949, tem sido utilizado para medir a propriedade mecânica de um material, a uma taxa de carregamento muito elevada. O aparelho é constituído por duas barras com uma amostra colocada em contacto entre as barras. Uma onda de tensão, criada na barra incidente, se propaga para a amostra, onde a onda se divide em uma onda reflectida e transmitida. A tensão da amostra é proporcional à onda transmitida. No presente estudo, nós utilizamos uma câmara de pressurização da célula a ser colocado entre as duas barras da Kolsky set-up. </li><li> As duas barras de liga de alumínio (cada comprimento de 6 m) estão suspensos por chumaceiras de bronze alinhados, e uma câmara de pressurização in vitro de células é colocado entre as barras. O bar é o bar a montante incidente com uma massa 130 lb presa em uma extremidade. Um grampo de fricção é colocado numa posição em que vai dar a duração do impulso desejada. Ao envolver-se a braçadeira de aperto e um macaco tesoura entre a massa e um suporte de carga, a secção de aperto de massa da barra de incidente é pré-compressed para o nível desejado. Forçar um parafuso entalhado que trava o grampo para uma ruptura brusca com um sistema hidráulico libera a compressão pré-armazenados rapidamente e, assim, gera um impulso de pressão. Esta propaga-se através da barra incidente, acciona o êmbolo da câmara de teste, e pressuriza o fluido e as células dentro da câmara de impulso. A pressurização da câmara, por sua vez inicia uma pressão de pulso de propagação a jusante da barra de transmissão. As estirpes associadas com os impulsos de pressão das barras são medidos com medidores de compostos de alta resistência de tensão excitado a 45 volts. Os sinais de calibre são gravados com um osciloscópio digital na freqüência de 1 MHz, como uma história de carregamento. </li><li> In vitro a câmara de pressurização da célula é constituída por um êmbolo do cilindro. O cilindro tem 2,6 cm de diâmetro interno e 3,8 cm de diâmetro exterior, e tem um pequeno orifício aproveitado na base da cavidade. O orifício serve de ar de ventilação e o excesso de líquido da amostra durante a instalação da célula. O pistão é de 7,5 cm de comprimentoe é feita a partir do material de barra mesmo. O pistão é envolvido com duas a três camadas de fita de encanador (Teflon), que servem como selo de baixo atrito. A tampa de extremidade é de 32 mm de comprimento e tem dois pequenos parafusos de aço inoxidável que fixam as lamelas de vidro (no qual as células são cultivadas), durante o carregamento. </li></ol> 3. Pressurização impulsivo de células neuronais <ol><li> Todas as peças da câmara de pressurização são esterilizados utilizando a autoclave e são mantidos sob luz UV. A montagem da câmara é realizada no interior da capa de cultura de células. O parafuso de purga na câmara é fracamente envolvida na entrada de ar na base da cavidade. Pré-aquecido (37 ° C) de meio de crescimento fresco é pipetada para dentro da câmara, sem fazer bolhas. Em seguida, uma lâmina de vidro de células de cultura é recolhida, e é colocado sobre a tampa do êmbolo (células voltados para fora). Os pequenos parafusos que prendem são apertados para o slide para segurá-la no lugar. O êmbolo com uma lâmina de vidro de células cultivadas é inserido um pequeno into da cavidade da câmara, e o conjunto é inclinado com a abertura estar no ponto mais alto. O parafuso de purga é removida e o pistão é empurrado para dentro da primeira cavidade obrigando as bolhas de ar, em seguida, o excesso de líquido. Ou uma marca de referência ou um gabarito é utilizado como um guia para assegurar o mesmo volume de meio de cultura para cada teste. A dimensão axial da mídia na câmara é de cerca de 6 mm. Higienizar o parafuso de purga e substituí-lo para fazer a água da câmara apertado. A câmara não deve vazar sob esta carga estática, se isso acontecer, o envoltório Teflon precisa ser substituídos ou reforçados. </li><li> Neste ponto, o sistema de barra Kolsky é reposto. A massa pesada é transferida de volta para a posição original e um parafuso de travamento novo substitui o utilizado (quebrado) um. O trinco de bloqueio novo com o sistema hidráulico para cerca de 200 psi. Usar a tomada de uma tesoura para comprimir a secção de pré-carregamento da barra incidente, até um pouco de pressão mais elevado do que o valor desejado, e depois voltar-off para envolver o atrito total doparafuso de Jack. A aquisição de dados agora está armado. </li><li> A câmara de pressurização da célula montada é montado no sistema. Ela é colocada num bloco V suportada pela pequena tesoura jack laboratório e em linha com as duas barras. Unte cada interface com uma camada de graxa leve e esfregar as superfícies cabeçadas em conjunto para eliminar as lacunas de ar entre eles. </li><li> O teste está agora pronto para prosseguir. O parafuso de fixação braçadeira é forçado a quebrar rapidamente por bombear o motorista pinça hidráulica. A braçadeira vai separar e a aquisição de dados deve exibir os resultados. A história de pressurização da célula é determinada a partir das medições do calibre bar transmitida. Se a barra de transmissão utilizada é suficientemente longo, este deve ser apenas a partir da primeira perturbação para o ponto em que as medições mostram uma pressão negativa. A duração do pulso transmitido pode ser mais curto do que o impulso de acidente, se a bolha está preso. A magnitude pode não atingir a do pulso incidente, mas deve ter uma lon suficientementeg planalto antes da descarga. Caso contrário, quer uma bolha de ar grande na câmara selada ou um desalinhamento entre o conjunto e uma barra pode ter ocorrido. </li><li> A câmara de pressurização da célula é então removido e desmontado no interior da capa de cultura de células. O parafuso de purga é removido e o êmbolo é puxado livre da câmara. A lâmina de vidro de células de cultura é tomada a partir da extremidade do êmbolo. </li></ol> 4. Avaliando o comportamento das células pressurizada <ol><li> Após a pressurização, as células podem ser inspeccionadas imediatamente ou ainda incubada para posterior exame. Com processos adequados de operação de assepsia, de longo prazo pós-incubação é possível. </li><li> Células sob pressão pode ser examinado por todas as técnicas de biologia molecular e celular. Especificamente para a pressurização da célula neuronal, para investigar a fisiologia celular e molecular, em condições de TBI, os ensaios de avaliação de pressão induzidas por alterações no crescimento de neurites, a mudança de microtúbulos do citoesqueleto neuronal, Expre genession apoptose, etc, pode ser realizada. Como amostras de controlo de células, as células que são cultivadas na mesma, mantida no interior da câmara de pressurização para o mesmo período de tempo, mas não pressurizado são utilizados (assim chamada, câmara de controlo). </li><li> Para avaliar as alterações no crescimento de neurites, as células de controlo submetidas a pressão e da câmara são examinadas por microscópio óptico imediatamente após a pressurização e 1 e 24 h de pós-incubação. Um exemplo de imagens de células neuronais são mostrados na seção &quot;Resultados representativos&quot; (Figura 2). A mudança de comprimento de neurites pode ser quantificado por coloração imunofluorescente actina e análise de imagem. As células são fixadas com uma solução de paraformaldeído a 4% w / v, lavou-se com um 0,05% v / v de Tween-20 tampão de lavagem, e permeabilizadas com um v / v 0,1% de Triton X-100 a solução. Após o bloqueio com um w / v de bovino a 1% solução de albumina de soro, as células são incubadas com o isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)-faloidina conjugada. Imagens de imunofluorescência das células são colhidas utilizando um fluorescentemicroscópio e os comprimentos das neurites de células pressurizados e de controlo são quantificados utilizando o software ImageJ (NIH). </li><li> As neurites pode ser identificado como axônios ou dendritos. Para avaliar as alterações morfológicas nos axônios ou dendritos, os experimentos acima descritos podem ser repetidos, utilizando anticorpos de detecção de cada estrutura, ou seja, um anticorpo de neurofilamento (NF) para axónios e do microtúbulo associado à proteína de anticorpo (MAP2) para dendrites. </li><li> Os microtúbulos são um dos principais componentes do citoesqueleto de neurónios, e os danos aos microtúbulos tem sido utilizada como marcador de lesão neuronal. Microtúbulos 2 pode ser visualizada usando o anticorpo imunofluorescência β-tubulina. As células são fixadas após 0 e 24 h de pós-pressurização, coradas com anticorpo β-tubulina, e observadas ao microscópio de fluorescência. </li><li> Para avaliar o efeito da pressurização impulsiva na expressão do gene neuronal apoptótica e, de ARN total é extraído a partir de células submetidas a pressão e de controlo. Genexpressão e pode ser examinado através da realização de RT-PCR quantitativo em tempo real ou RT-PCR, semelhante aos nossos protocolos publicados. 3 </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Um exemplo de perfil de pressão aplicada às células no interior da câmara de pressurização. O aparelho bar Kolsky sucesso gera nível 2 MPa, um único pulso de pressurização tipo impulsivo, com uma duração de cerca de 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Um exemplo de resposta de células neuronais de pressurização impulsivo. SH-Sy5y células expostas a pressurização impulsivo a 2 MPa mostra colapso neurite / axon distinta em relação às células de controlo da câmara. 6. Dificuldades e Soluções <ol><li> Câmara de vedação é um dos principais obstáculos a serem superados. É found que os discos de largura, com o-rings tem um problema de cinzelamento e atrito maior. A fim de eliminar os efeitos de fricção, bem como evitar cinzelamento, um simples método de gravação do pistão com a fita de Teflon canalizador é usado. Isto resolve os problemas e produz o nível de pressão desejado e duração. </li><li> Comportamento da célula neuronal pressurizado, especialmente quando se avalia mecanismo TCE secundário ou efeitos a longo prazo, deve ser examinada depois de um tempo pós-incubação longo. A câmara contendo as células é exposto a condições potencialmente não esterilizadas enquanto se move para a barra Kolsky, pressurizando, e movendo-se para trás para o capuz de cultura de células. Com a esterilização prévia das partes da câmara e do funcionamento apropriado de montagem / desmontagem da corrediça de células cultivadas e câmara no interior da capa de cultura de células, de longo prazo pós-incubação é possível até várias semanas. </li><li> A reprodutibilidade dos dados é um parâmetro importante em celulares experiências de estimulação mecânica. Para o nosso dispositivo, o reproducibility em resposta celular neuronal é determinada como desejado perfil de pressurização impulsivo, nos dois níveis de pressão e duração, é repetidamente obtidos. Uma vez que o perfil de pressão gravar obtido para cada pressurização, os dados de resposta de células a partir de perfil de pressão não desejada pode ser manualmente excluída depois. </li><li> As etapas de pressurização inteiras, incluindo a montagem da câmara de transferência e montar na barra Kolsky, a pressurização, a transferência de recurso, e a desmontagem da câmara, ter menos de 10 min. A corrediça próxima célula de cultura pode ser pressurizado imediatamente após a pressurização anterior. Assim, um número suficiente de experiências de pressurização pode ser completado de forma eficiente. O nosso set-up utiliza 18 milímetros lamínulas de diâmetro. Um experimento pressurização não fornece proteínas suficientes para inmunotransferência devido ao tamanho do substrato (e também em parte por causa de algumas das células submetidas a pressão são mortos). Cerca de três experimentos de pressurização repetidas fornecer quantidade de proteína necessária para immunoblOtting. Mais uma vez, a reprodutibilidade é verificada cada vez com o perfil de pressão. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Muitas das técnicas experimentais in vitro têm sido tentadas para estudar os danos das células cerebrais em condições de TCE. Estes incluem neurônio / astrócitos alongamento, tensão de escoamento induzido cisalhamento, queda de peso, laceração caneta, laser transecção, litotripsia, etc 4,5 Assumiu-se que de curta duração sobre pressão é um fator dominante física para TCE. 6,7 Especialmente , a onda de choque da explosão TCE tem uma duração de pulso de uma ordem de milissegundos. 4 Com base neste pressuposto e observação, câmara barômetro capaz de pressurização transiente foi desenvolvido e utilizado para avaliar o comportamento de células do cérebro em condições de TCE. Por exemplo, no fluido de percussão barotrauma câmara de um impulso de pressão com 20-30 ms de duração longa e um pico de pressão de até 0,5 MPa foi usada para examinar o comportamento de células glial humana sob o TCE. 6 Recentemente, VandeVord et al. 7 metal usado bola câmara barômetro marcante para examinar a célula astrócitoscomportamento sob TCE, mas a bola de metal dramáticas produzidas pulsos de pressão múltiplos. No presente estudo, nós desenvolvemos um dispositivo de pressurização novel célula que gera um único pulso de pressurização tipo impulsivo. O dispositivo foi desenvolvido com base na barra de Kolsky configuração, que tem sido utilizado como um aparelho de ensaio de materiais em nossos 8 e de outros estudos. 1,9 O bar Kolsky da capacidade de teste de material em taxa de carga muito elevada foi modificado para ser capaz de aplicar um único pulso de sobrepressão tipo para as células de cultura no interior da câmara de pressurização (Figura 1). Poderíamos conseguir controlar a magnitude e duração da sobrepressão impulsivo. Como uma resposta das células representativo, foi demonstrado que a 2 MPa de pressão SH-Sy5y células neuronais exibir neurite significativo e perda axonal, em comparação com células de controlo não pressurizados de câmara. Em conclusão, foi desenvolvido um novo aparelho de pressurização impulsivo célula usando um Kolsky especialmente concebidodispositivo bar e demonstrou seu potencial para utilização em investigar a resposta celular neuronal em condições de TCE. Observamos também que esta técnica é muito versátil na medida em que qualquer tipo de células podem ser expostas a pressões impulsivas em níveis diferentes e duração. Portanto, o dispositivo pode ser usado para investigar o impulsivo pressão induzida comportamento mecanotransdução celular, não só para ferir as células, mas também para estimular as células positivamente na sua função e determinação destino.

<ul><li> SH-Sy5y (ATCC, CRL-2266), as células de neuroblastoma humano </li><li> 18 lamínulas mm de diâmetro </li><li> Meios de cultura de células: DMEM, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina </li><li> Ácido retinóico (10 mM) para induzir a neurogénese </li><li> Kolsky barra de dispositivo de pressurização impulsivo </li><li> Pistão-cilindro de câmara de pressurização da célula </li><li> Parafusos de aço inoxidável para proteger lamela células cultivadas no pistão </li><li> Graxa para interfaces entre células na câmara e bar Kolsky </li><li> Gerais de biologia molecular suprimentos para avaliar a resposta de células de pressurização (fixador, anticorpo, corante fluorescente, o abastecimento de PCR, etc) </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar explosão induzida por traumatismo crânio-encefálico (TCE). Demonstramos neste artigo de vídeo como a pressurização explosão TBI-impulsivo relevante é aplicada às células neuronais in vitro. Isto é conseguido através da utilização bem controlada pulso de pressão criado por um dispositivo especializado Kolsky bar, com história completa da pressão no interior da câmara de pressurização da célula registada. Pressurizados células neuronais são inspeccionadas imediatamente após a pressurização, ou ainda incubadas para examinar os efeitos a longo prazo de pressurização impulsivo sobre neurite / axonal outgrowth, a expressão do gene neuronal, apoptose, etc observou-se que a pressurização impulsivo a cerca de 2 MPa relativos induz perda distinta neurite de células não pressurizados. A nossa técnica proporciona um método novo para investigar os mecanismos moleculares / celulares de explosão TBI, através de pressurização impulsivo de células cerebrais em bem controlada prEssure magnitude e duração.

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar os mecanismos moleculares / celulares da explosão induzida lesão cerebral traumática.

Pressurização impulsivo de células neuronais de Estudos Traumático Brain Injury

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K visualizações.  University of Nebraska-Lincoln. Um experimento de pressurização romance impulsivo celular foi desenvolvido utilizando um dispositivo de bar Kolsky para investigar os mecanismos moleculares / celulares da explosão induzida lesão cerebral traumática.

Vídeo: Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Bioengenharia

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

Treinar Pessoas com lesão medular de deambular Usando um exoesqueleto energizado

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Segmentação Neuronal fibra folhetos para a terapia de estimulação profunda do cérebro usando modelos interativos, paciente específico

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...