Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, (número de concessão IOS-0842701 para CAC) e do Instituto Nacional de Saúde (R00MH080599 a BY, R21 NS062313 a NC, e NS069844 para CAC). Gostaríamos de reconhecer James Schutt, Emily Han, e Leni Truong para suporte técnico, eo Banco Centro Bloomington para linhas de voar. Todos os chips foram fabricados no Centro de Lurie Nanofabricação da Universidade de Michigan.

1. Fazer o Chip PDMS Para fazer com que um chip de PDMS do molde SU-8, siga os passos de 1,1-1,7. Se um chip é na mão, mas precisa montado para uso, pule para o passo 1.8. <ol><li> Misture 45 g de base de PDMS e 4,5 g de agente (proporção 10:1) a cura de um kit de PDMS em um pequeno recipiente de plástico descartável e misture-os cuidadosamente, com uma vareta de plástico. </li><li> Colocar o recipiente num recipiente de vácuo (por exemplo, um secador) durante 10 minutos para remover quaisquer bolhas. </li><li> Coloque o molde SU-8, na parte inferior de um diâmetro de 150 mm de prato plástico e verter lentamente a mistura de PDMS no molde. Tome cuidado para não gerar bolhas ao derramar o PDMS. </li><li> Curar o PDMS no forno (ou um incubador) a 650 ° C durante 4 h. </li><li> Retire o molde PDMS/SU-8 curado do forno e deixe esfriar por alguns minutos. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar o PDMS curados ao longo da borda do molde SU-8 e retirá-la da SU-8 molde. </li><li> Divida a laje PDMSPDMS em fichas individuais, usando uma lâmina de barbear. </li><li> Usando uma agulha de distribuição de 21 L, fazer um buraco na porta de vácuo (ilustrado na Figura 1A) do chip de PDMS. </li><li> Dê uma distribuição agulha 23 G e torça a ponta da agulha de sua base algumas vezes para quebrar a agulha ponta fora do cubo de bloqueio. </li><li> Inserir a agulha da ponta 23 L em um pequeno pedaço de tubo de polietileno de modo a que o tubo de cobre, pelo menos, um milímetro da agulha. Em seguida, utilizar uma lâmina de barbear para cortar o excesso de tubo para longe da agulha. Isto cria um anel de plástico em torno de uma extremidade da agulha, o que vai criar um selo, quando inserido na porta de admissão de vácuo. </li><li> Para uso com um microscópio invertido (Figuras 1B e 2A-B): inserir a ponta de agulha 23 G no orifício do canal de vácuo. Para uso com um microscópio vertical (Figuras 1C e 2C-D): picar um segundo furo no lado do chip PDMS com uma dispe 21 Lnsing agulha, o buraco vai fornecer acesso para o primeiro buraco do lado. Em seguida, insira a agulha ponta 23 G com anel de tubulação no orifício lateral. Coloque um pedaço de fita adesiva de dupla face sobre a parte superior do chip PDMS para vedar o orifício superior (Figura 1C). </li><li> Pegue um pedaço de tubo de polietileno que é de aproximadamente 20 cm de comprimento. Conectar um lado do tubo para a ponta da agulha que é inserida dentro do orifício de vácuo. </li><li> Conecte o outro lado da tubulação para uma das portas de uma válvula de 3 vias (ver &#39;3-way torneira &#39;na lista de materiais) </li><li> Anexar uma seringa de 20 ml em uma das duas portas restantes. A última porta é aberta para o ambiente. </li></ol> 2. Usando o Chip Zergling de Imagens ao vivo <ol><li> Limpe o chip PDMS com fita adesiva transparente. Fixe um pedaço de fita para o fundo do chip. Verifique se a fita está tocando toda a superfície de PDMS e, em seguida, retire a fita. </li><li> Repita o passo acima de 2 a 3 vezes para garantir que nãoexistem partículas de óleo (ou retidos a partir de experiências anteriores) sobre a superfície do chip PDMS. Uma vez que o chip PDMS é reutilizável, isto é muito importante para remover os resíduos de óleo, uma vez que podem afectar a adesão do PDMS de vidro e resultar em selagem inadequada. </li><li> A transferência precoce (isto é forrageamento) larvas 3 º a uma placa de Petri contendo água. (O rd larvas fase A alimentar 3 instar são os alimentos, ao invés de a parede do frasco de cultura). Lavar os larvas em água para remover o meio de cultura. </li><li> Dê uma lamela de vidro limpa e coloque uma pequena gota de óleo halocarbônico 700 em seu centro. </li><li> Utilizando uma pinça, escolher com cuidado um limpo, early-encenado 3 º instar larva da água (a larva deve ser ~ 3,5-4 mm de comprimento). Colocar o animal brevemente em um leve limpa ou papel toalha para remover o excesso de água, e, em seguida, coloque-o sobre a queda do petróleo. A redução deve ser suficientemente pequeno de tal modo que a traqueia de larvas não são revestidos. Deixe o sta larvay sobre a gota de óleo por 10 segundos. </li><li> Retire a larva da gota de óleo e, em seguida, coloque-o sobre uma lamela de vidro limpo. </li><li> Transfira a larva para outra lamela de vidro limpo. Esta etapa remove o excesso de óleo. </li><li> Preste atenção à orientação larva. For Imaging o cabo e os nervos segmentares neurais, o lado ventral de larva deve sentar-se na lamela. Seu lado dorsal, caracterizada por dois tubos traqueais longitudinais, deve estar voltado para cima. Nota: esta é a orientação da larva prefere naturalmente. </li><li> Suavemente colocar o chip PDMS no topo da larva. A larva deve estar alinhado ao meio centro da MicroChamber, com a cauda voltada para a porta de vácuo. Tenha cuidado para que a larva não toque nas bordas da câmara. Isto é especialmente importante para os terminais anterior e posterior da traqueia. Nota: este passo é o melhor feito sob microscópio estereoscópico. </li><li> Empurre o chip PDMS contra a lamela de vidro para conseguir uma boa vedação. Certifique-se de que a larva é totalmentedelimitada pela MicroChamber quando o chip PDMS está tocando a lamela de vidro. </li><li> Alternar a válvula de 3 vias em tais que a seringa pode extrair o ar da microcâmara de PDMS (através da tubagem) para criar um vácuo. </li><li> Com uma mão, segure a lamela chip de PDMS / vidro com firmeza. Use a outra mão para puxar o êmbolo da seringa. Retire 2-2,5 ml de ar, até sentir resistência no punho seringa, para criar vácuo. O vácuo produz um vedante estanque entre o chip de PDMS, óleo, e interfaces de lamela e restringe a mobilidade da larva. </li><li> Alternar a válvula de modo a que o chip PDMS é isolado a partir da seringa e do ambiente. Como resultado, o nível de vácuo relativamente estável é mantida na microcâmara, sem a necessidade de segurar o êmbolo da seringa. </li><li> Verifique a larva sob o estereoscópio para certificar-se que a totalidade do corpo do animal é colocado no interior da microcâmara, e que o animal permanece imóvel. A traquéia deve ser visível. O resto doChip de PDMS deve estar em contato com a lamela. Nota: Ver Figuras 2E e 2F para exemplos de animais corretamente imobilizadas no chip. Algumas orientações incorretas são mostrados nas Figuras 2G e 2H. </li><li> Colocar o chip larva (chip PDMS + lamela de vidro) sobre o microscópio. O chip de larva, a tubulação ea seringa deve ser manuseado com cuidado para evitar desprendimento do chip PDMS da lamela. Para um microscópio vertical, fixe o lado &#39;top&#39; do chip para o palco microscópio com fita dupla face (Figura 1C). </li><li> Utilize uma objectiva de grande ampliação (de imersão em óleo, 40-63X é recomendado) para localizar a estrutura (s) do animal de interesse e realizar a imagem. Em alguns casos, um aumento inferior pode ser necessária para identificar a região desejada para imagiologia antes de mudar para uma ampliação maior. </li><li> Quando imagem está completado, libertar o vácuo pela comutação da válvula para a posiçãoque é aberto para o ambiente. </li><li> Retire o chip PDMS da lamela. A larva deve ser imediatamente móveis. </li><li> Fórceps para remover a larva da microcâmara e colocar gentilmente a larva em uma placa de agar de uva-suco para recuperação. </li></ol> 3. Induzir uma lesão do nervo esmagamento de nervos larval segmentares <ol><li> Siga o passo 2.3 para isolar cedo encenado 3 ª larvas do genótipo desejado. Tal como descrito no passo 2.3 banhar as larvas em água para remover o alimento. </li><li> Use uma mosca CO 2 estação anesthetization padrão, com CO 2 pad mantidos sob um microscópio estereoscópico dissecação, para subjugar as larvas. As larvas devem se tornar immotile após a colocação em CO 2 pad para 1-2 min. </li><li> Agora coloque uma única larva anestesiado em uma placa de ágar suco de uva sob o microscópio estereoscópico. Vire animais lado ventral até visualizar o cordão nervoso ventral e segmentar os nervos através da cutícula ( <strong&gt; Figura 3). Certifique-se de que a larva é completamente imóveis. </li><li> Usando Dumostar número 5 fórceps, beliscar os nervos segmentares firmemente através da cutícula para 5-10 seg. Quando isto é feito correctamente, a cutícula permanece intacta e a parede do corpo não é perfurada. Nota: A lesão pode ser realizada em diferentes posições ao longo do eixo ântero-posterior do corpo, enquanto o cabo de nervo ventral, glândulas salivares, intestino e não está danificado. O local da lesão é mais eficaz para o fim do segmento abdominal 3 rd, como mostrado na Figura 3D. Lesão neste local danos a maioria dos nervos e é o mais fácil de se reproduzir sem matar o animal. </li><li> Após a lesão, gire o animal para que seu lado ventral para baixo a placa de uva. Ele deve ser capaz de mover a cabeça e comer. Se a lesão foi bem sucedida, então a metade posterior da larva será paralisado. </li><li> Manter os animais feridos na placa de ágar suco de uva a 25 e# 176; C para o tempo desejado de acordo com o objetivo experimental. Para motoneurônios, o coto proximal começa a brotar dentro de 8-10 horas de lesão 14, e do coto distal começa a degenerar dentro de 6-8 hr 15. Para a classe IV da neurônios sensoriais, o coto proximal começa a brotar dentro de 4-6 horas, eo início do coto distal a degenerar dentro de 3-4 horas após a lesão. Nota: com drivers adequados Gal4 e repórteres fluorescentes, o surgimento e degeneração pode ser observado no chip larva (por exemplo, ver a Figura 6). </li></ol>

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Fazer ou obter o chip larva: O chip larva consiste num bloco de PDMS (denominado o &quot;chip PDMS &#39;) ligado a uma lamela de vidro. O protocolo no passo 1 descreve o procedimento para fazer e usar chips de larva, assumindo um molde de SU-8 está disponível. O molde SU-8 é microfabricados por photolithographically padronização uma espessa camada de SU-8 photoresist 140 mM em uma pastilha de silício (para detalhes, ver 12 Ghannad-Rezaie et al.). Como a microfabricação do molde SU-8 exige o acesso a equipamento especializado, recomendamos requisitá-lo a partir de uma instalação de microfabricação (por exemplo. A facilidade LNF na Universidade de Michigan 14), ou a partir de uma fundição, enviando-lhes o design de chips que é fornecido como arquivo suplementar. Se alguém deseja mudar o design do chip PDMS (por exemplo, para uso com larvas de diferentes tamanhos), um software CAD que lida com arquivos DXF (ex. Autocad) pode ser usado. Uma SU-8 molde também pode ser feita em casa seguindo as instruções na Mondal et al. 27 Muitos leitores podem achar que é conveniente para simplesmente obter um chip PDMS amostra para experimentar a técnica antes de fabricar seus próprios chips. Este será disponibilizado gratuitamente, mediante solicitação. O uso do micro &quot;chip larva&quot; para imagens ao vivo: O método de imobilização no chip larva evita a utilização de anestésicos, e envolve, em vez da pressão, através da aplicação de um vácuo, para restringir o movimento do animal. Enquanto os animais podem sobreviver imobilização no chip para várias horas de 12, um período curto de imobilização (5-15 min) é recomendado. Isso é tempo suficiente para a imagem de muitos eventos celulares de interesse, incluindo alterações de cálcio intracelular, ou transporte axonal rápido. Este também é o tempo suficiente para manipulações desejados em animais vivos, como base de laser microcirurgia, fotodegradação e photoconverSion. Para estudar eventos longitudinalmente ao longo de um período de tempo maior em um único animal, os animais podem ser colocados no chip e fotografada várias vezes, separadas por períodos de repouso. Placas de ágar suco de uva são ideais para o descanso entre as sessões de imagem, uma vez que proporcionam uma fonte de alimento fácil e umidade. Várias sessões de imagem afetam a sobrevivência larval até certo ponto, uma vez que cada sessão acarreta alguns riscos para danificar o animal (ver parte 2 na solução de problemas, abaixo). Os animais podem ser rotineiramente fotografada&gt; 5 vezes ao longo de dois dias, com uma taxa de sobrevivência superior a 50%. Uma vez que os animais não são anestesiados, são saudáveis ​​e móveis imediatamente após a libertação do vácuo no chip. Assim, não há necessidade de tempo de recuperação entre as sessões de imagem, de modo que o espaçamento de tempo entre as sessões é flexível e pode ser ajustada para os objetivos do experimento. Solução de problemas: A técnica mais comum éprocessa com chip de larva e soluções recomendadas são as seguintes: (1) O animal está se movendo muito. Muita mobilidade pode interferir com os objetivos de imagem. As razões mais comuns para este no chip larva são a) o animal é muito pequeno para o chip, ou b) a pressão de vácuo aplicado durante a fase de imobilização está comprometida. O chip larva descrita neste protocolo é projetado para o início de encenou larvas 3 º. O tamanho ideal para o animal é 3,5-4 mm de comprimento (ao longo do eixo ântero-posterior). Para garantir que a pressão de vácuo é suficiente puxar a seringa 2-2,5 ml, ou até se sentir resistência no punho. Uma indicação de que o vácuo está em funcionamento é que pequenas bolhas no canal de perímetro pode ser visto movendo lentamente para a fonte de vácuo. Outra indicação é que a lamela deve sempre viajar com o chip quando o chip é levantada a partir do topo (e este é o método recomendado para o transporte da câmarauma vez que as larvas é posicionada e o vácuo é ligado). O vácuo pode ser comprometida se há fissuras no tubo, ou se houver óleo na tubagem. Isto pode ser facilmente resolvidas por substituição do 23 L de distribuição de ponta de agulha e de polietileno de 50 tubos (de passos 1,6-1,14). (2) O animal morre depois de imagem no chip. O processo destina-se a causar o mínimo de stress sobre o animal, e animais de genótipo de tipo selvagem tem uma taxa de sobrevivência de&gt; 90%, mesmo após uma hora de imobilização sobre o chip 12. Uma vez que alguns genótipos podem ser menos resistentes ao estresse do chip, verifique primeiro que tipo selvagem animais (por exemplo, Canton S) sobreviver à técnica de imobilização. a) A causa mais comum para a letalidade é o posicionamento incorreto da larva (ver Figuras 2G-H). Se partes da cutícula, cabeça ou traquéia não são inteiramente dentro da câmara, então eles podem ser danificados durante a imobilização, e umalarva que é demasiado grande para o chip (&gt; 4 mm) é menor probabilidade de sobrevivência. b) Uma causa menos comum para a letalidade é a utilização de um excesso de pressão ou de vácuo, quando o carregamento do chip. Quando posicionado adequadamente no chip, a pressão gerada pelo vácuo é bem tolerada. No entanto o excesso de pressão, quer do vácuo ou na fase inicial de posicionar o animal pode ser um problema. É melhor aprender o grau de pressão necessária empiricamente por testes com tipo selvagem larvas do tamanho correto. c) Se muito óleo halocarbônico cobre traquéia do animal o animal pode, potencialmente, ter problemas com a sobrevivência a longo prazo. O óleo desempenha vários papéis importantes no chip: é importante para a criação do vácuo, as ópticas durante o exame, e neutraliza a dessecação no chip. No entanto óleo excessivo deve ser evitado. (Isto pode também levar a óleo no tubo e seringa comprometer a vácuo). Os casacos protocolo sugerido apenas o lado ventral da larva com óleo, então removes excesso de óleo por colocação da larva em uma lamela limpa antes de se transferir para a lamela final para geração de imagens. d) fototoxicidade pode ser experimentado a partir da sessão de imagem. Como acontece com qualquer aplicativo de imagem ao vivo, é ideal para usar os tempos de exposição de curta duração, com baixa intensidade de luz laser, o que é melhor alcançada usando uma câmera de alta sensibilidade ou detector. Tentar minimizar iluminação com luz UV, incluindo a luz de amplo espectro criado por fontes de luz de Hg. Outras questões e direções futuras: Uma vez que este método não utiliza anestésicos, coração do animal continua a bater. Isso cria alguma mobilidade inevitável, o que afeta de imagem em alguns locais mais do que outros. Os exemplos aqui apresentados demonstram que o cabo ventral do nervo, nervos segmentais, e da parede do corpo pode ser facilmente trabalhada, sem a interferência do batimento cardíaco. Nos casos em que o batimento cardíaco afeta imagem, os movimentos regulares às vezes pode ser corrigido para comem software de análise (por exemplo, o Estabilizador de Imagem plugin para o ImageJ). Isso funciona bem quando os objetos individuais estão se movendo em uma escala de tempo rápido (por exemplo, ~ 1 mícron / seg para o transporte axonal rápido) ou em uma escala de tempo muito lento (minutos a horas). No entanto, quando o objecto (s) de interesse com o movimento de uma gama de velocidades e direcções, pode ser mais difícil de corrigir para os movimentos de batimento cardíaco induzido. Outra questão é pequena variabilidade na óptica de animal para animal, ou entre várias sessões de imagem do mesmo animal no chip. Quanto mais profundo o objeto de interesse está dentro do animal, maior será essa variação será. Nervos segmentares e cordão nervoso ventral são normalmente muito profundo dentro de então animal para ser trabalhada em um microscópio regular. No entanto, a pressão moderada com experiência no chip de larva empurra estas estruturas muito próximo da cutícula e lamela. A distância exata destas estruturas da lamela terá pequenas variações de trial a julgamento. A variação para objetos fechar a cutícula, como os corpos celulares dos neurônios sensoriais, é menor. Por conseguinte, é importante, em particular para fazer as medições de intensidade, para utilizar um grande número de animais e ensaios independentes para explicar a variabilidade em óptica. Enquanto os exemplos mostrados aqui têm-se centrado sobre os processos dentro dos neurônios, a abordagem deve ser passíveis de imagiologia qualquer estrutura no animal que pode ser trazido dentro da profundidade de focagem da objetiva do microscópio. Isto inclui a cutícula, músculos da parede do corpo, e seus NMJs. Traqueia no lado ventral do animal e, potencialmente, partes do tracto digestivo, também pode ser convertido em imagem. O animal pode igualmente ser posicionada com o lado dorsal para a lamela para imagiologia de curto prazo das estruturas perto da superfície dorsal. A capacidade de estruturas de profundidade da imagem dentro do animal é limitada pela distância de trabalho do objectivo microscópio utilizado. Estruturas como imdiscos aginal são inacessíveis para grande ampliação (por exemplo, 40x) objetivos. Os chips larva descritos neste protocolo são projetados para as larvas no início da 3 ª etapa instar (que variam em tamanho 3,5-4 mm). No entanto, muitas questões interessantes exigem imagens em diferentes estágios larvais. Chips menores para acomodar 2 ª larvas instar, ou chips maiores para acomodar final 3 ª estádios podem ser facilmente projetados usando o mesmo princípio. (Figura Suplementar 1 contém um arquivo DXF facilmente modificável para fazer moldes de silicone com tamanhos de câmara alterados). O simples princípio da vedação reversível pode mesmo ser aplicado a outros microorganismos, tais como C. elegans ou peixe-zebra, com a variante principal é o tamanho da câmara. A futura direção útil é criar um chip que pode imobilizar muitos animais ao mesmo tempo, a utilização para fins de triagem. No entanto, para isso, o desenho teria de ser significativamente diferentea partir do dispositivo atual, em que as questões de posicionamento do animal em o chip precisa ser tratada por cada animal de forma independente. O ensaio esmagamento do nervo para o estudo de respostas de lesões nos nervos periféricos das larvas: O ensaio esmagamento do nervo descrito aqui para nervos segmentares larval é um método simples para a introdução de uma lesão axônios periféricos em Drosophila. As vantagens deste método são: a) é simples de conduzir com ferramentas padrão encontrados em um laboratório de Drosophila (a fonte de CO 2 e fórceps estereoscópico), b) pode ser realizada rapidamente para muitos animais, fazendo com que a análise bioquímica de cordões nervosos após a lesão viável 14, c) as respostas celulares e moleculares para esta lesão são altamente reprodutível 14,15,28 e pode ser utilizado para descobrir processos que também são importantes em vertebrados neurónios 29,30. Métodos alternativos para ferir os neurônios é focusa laser de alta potência, por exemplo, um-UV pulsada ou laser de femtosegundos, para cortar um axônio via microcirurgia a laser 17,31-33. O chip larva é um método ideal para o posicionamento do animal para tal microcirurgia. No entanto, por causa das pequenas diferenças na óptica entre ensaios, discutidas acima, o método à base de laser pode ser mais difícil de reproduzir de larvas, especialmente nos nervos segmentares larvares. Além disso, a base de laser lesão axonal requer mais tempo para posicionar cada um dos animais, por conseguinte, é mais difícil de realizar em grande escala (com um grande número de animais). Solução de problemas: A questão técnica mais comumente encontradas a partir do esmagamento do nervo é a morte de danos aos órgãos internos. Ao realizar a paixão, é importante para não prender o cabo ventral do nervo, glândulas salivares, ou intestinos. Também é importante não perfurar a cutícula. Estas questões devem ser evitados, trazendo a pinça em um ângulo de 45 ° para a sup cutículae (ver Figura 3). A qualidade da pinça tem um grande impacto sobre a eficácia do esmagamento e sobrevivência depois. Recomendamos número Dumostar 5 fórceps. Para manter a sua nitidez, a pinça deve ser manuseado com cuidado, não utilizados para outros fins, e substituído, uma vez que tornam-se sem corte ou dobrados. O tamanho do animal também pode influenciar a eficácia do esmagamento. Pequenos animais (menos de 3 mm de comprimento) são muito menos propensos a sobreviver à lesão. Com grandes animais, (3 rd errante estádios), é mais difícil localizar os nervos e evitar danos para as maiores glândulas salivares e intestino, e há menos tempo para estudar as respostas de lesão antes pupation. O esmagamento do nervo é mais eficazmente conduzida em larvas cedo instar 3 º (que são ~ 3-4,5 mm de comprimento ao longo do eixo ântero-posterior). A fonte de alimentação que o animal é levantado em cima podem afectar oforça da cutícula e sobrevivência após a queda. Recomenda-se a criação de animais em alimentos feitos a partir de uma receita de levedura-glicose padrão. O melhor método para aprender a fazer o esmagamento de forma eficaz é a prática em muitos animais, primeiro com o objetivo principal de conseguir a sobrevivência (e não pupation) 24 horas após a queda. Iniciantes normalmente têm uma taxa de sobrevivência de baixo (por exemplo, 10%), mas uma vez que a técnica é aprendida, as taxas de sobrevivência pode chegar a 90%. Outras questões e direções futuras: O ensaio de esmagamento fornece um método poderoso para estudar o surgimento de axônio proximal ao local da lesão e degeneração de axônios e sinapses distais ao local da lesão. Enquanto as taxas de degeneração variar entre diferentes tipos de neurónios, que são altamente reprodutíveis dentro de um determinado tipo de neurónio, fornecendo prova da reprodutibilidade do ensaio de lesão. Em contraste, o &quot;regenerativa&quot; brotandoresposta observada nos axônios proximais é mais difícil de estudo. Todos os axônios no nervo segmentar iniciar extensa brotando perto do local da lesão (por exemplo, veja a Figura 6 e Figura 3). No entanto, o grau de germinação pode variar de neurônio para neurônio, e é difícil de quantificar. Um grau semelhante e variabilidade na germinação pode ser observado após lesões mais focais de neurónios motores individuais em nervos segmentares introduzidas por meio de um laser de corante pulsado UV. Nós interpretamos que a direcionalidade nondiscriminate do surgimento deve-se à ausência de pistas de orientação nos nervos segmentares. Em contraste, os axônios dos neurônios sensoriais feridas por laser de perto de seus corpos celulares passam por um novo crescimento axonal na mesma direção que o axônio perdeu 34. Os axônios nesta região do animal são provavelmente expostos a informação posicional mais específica para orientação dos axônios em regeneração. O ambiente dentro de nervos segmentares é improvável que tenha muito resemblanCE para o ambiente que os axônios originalmente navegou durante a sua orientação no embrião, portanto, não se espera que tenha informações para orientar os axônios em regeneração. Outra limitação para o estudo da regeneração utilizando o ensaio de esmagamento do nervo segmentar é que axônios sensitivos e neurónios motores feridos ainda tem uma distância significativa para cobrir (0,25-1 mm) para atingir a sua meta, e um período de tempo limitado (&lt;3 dias) antes que os animais sofre pupação. Um estudo recente identificou uma manipulação genética do receptor da hormona prothoraciotropic que triplica a duração do 3o estádio larval 35. Esta manipulação vai estender o período de tempo para estudar a recuperação e degeneração dos neurônios após a lesão de forma significativa, a 9 em vez de 3 dias. Este pode ser o tempo suficiente para observar os novos eventos, como religação de um axônio ferido com seu alvo pós-sináptica, especialmente se a lesão é induzida perto do final sináptica.

A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido utilizada como um organismo modelo para mais de 100 anos, e tem-se revelado fundamental na definição de sinalização fundamental e as vias de desenvolvimento que são conservados a partir de invertebrados para humano. Imagens ao vivo é uma abordagem importante para o estudo dos mecanismos celulares, eo plano corporal simples e cutícula translúcida da larva Drosophila torna um sistema atraente para geração de imagens ao vivo, especialmente porque há muitas ferramentas genéticas disponíveis para expressar proteínas fluorescente etiquetado em tipos específicos de células. Um desafio importante para as técnicas de imagem ao vivo é imobilizar e posicionar um animal para microscopia de forma não invasiva. Abordagens de imobilização convencionais incluem a dissecção 1,2 ou a utilização de clorofórmio, as quais matam o animal. Os anestésicos éter 4 e isofluorano 5-8 também têm sido utilizados. Embora os anestésicos proporcionar muitas vantagens, Eles também inibem a atividade neural e fisiologia importante (incluindo o coração) 9-11, portanto, pode afetar o processo de estudo e criar stress no animal. Também há preocupações de segurança humanos para trabalhar com éter e isofluorano. Nós desenvolvemos um método livre de drogas para imobilizar larvas Drosophila em um único dispositivo micro camada de PDMS, que chamamos de &quot;chip larva &#39;12. Este protocolo irá descrever como obter ou fazer o chip larva, e como utilizá-lo para imagens ao vivo no início de encenou larvas 3 º. O chip é composto de um microcâmara confortável-encaixe, que, aquando da aplicação de um vácuo através de uma seringa, imobiliza o animal por meio de força mecânica suave. O método de imobilização traz estruturas ventral como o cordão nervoso, os nervos segmentares e músculos da parede do corpo, nas proximidades de uma lamela de vidro. Isso permite que imagens de alta resolução de tais estruturas com alta aper numéricatura objetivos (alta ampliação). Vantagens do chip larva sobre outras técnicas convencionais incluem o seguinte: (i) O uso do chip larva substitui o uso de produtos químicos, permitindo a visualização in vivo dos animais não anestesiados. (Ii) As larvas se recuperar imediatamente após o lançamento do chip (em contraste com um período de recuperação de 2 horas para isofluorano 8,13). Isto permite uma imagem em escalas de tempo grandes, que variam de milissegundos a minutos, a horas e dias. (Iii) A utilização de PDMS, o que é um material permeável ao gás, permite a difusão contínua de oxigénio / ar do ambiente para dentro do corpo da praga. (Iv) O chip é fácil e seguro de usar, e (v) é reutilizável e pode ser fabricado a um custo mínimo. Além de instruções para usar o chip de larva, este protocolo prevê vários exemplos de seu uso para estudar eventos neuronais no 3 º larvas. Estes incluem imagens ao vivo de Axonal transporte, as respostas de cálcio por lesão, e os estudos de lapso de tempo do tráfico de proteínas foto-conversível em longas distâncias e escalas de tempo. Outra aplicação do chip é para estudar as respostas neuronais a lesão axonal. Por este um procedimento adicional é descrito (em parte 3) para ferir os axônios dentro nervos periféricos por um esmagamento do nervo segmentar. Este ensaio simples pode ser realizada tanto de forma rápida e reprodutível sob um estereomicroscópio dissecção padrão, o que permite que muitos animais a serem tratados ao mesmo tempo. As respostas celulares à lesão pode ser estudada por imagens ao vivo no chip larva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

Imagens ao vivo é uma técnica importante para o estudo de processos biológicos celulares, no entanto, isso pode ser um desafio em animais vivos. A cutícula translúcida da larva Drosophila o torna um organismo modelo atraente para estudos de imagem ao vivo. No entanto, um desafio importante para as técnicas de imagem ao vivo é imobilizar e posicionar um animal no microscópio de forma não invasiva. Este protocolo apresenta um método simples e fácil de usar para a imobilização e imagem larvas Drosophila em um polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivo micro, o que chamamos de &quot;chip larva. O chip larva é composta por uma microcâmara de PDMS-encaixe perfeito que está ligada a uma lamela de vidro fina, que, aquando da aplicação de um vácuo através de uma seringa, para imobilizar o animal e traz estruturas ventrais, tais como o cabo de nervo, nervos segmentais, e corpo músculos da parede, próximo à lamela. Isso permite que imagens de alta resolução, e mais importante, evita o uso de anesthetics e produtos químicos, o que facilita o estudo de uma ampla variedade de processos fisiológicos. Uma vez que as larvas recuperar facilmente a imobilização, que pode ser facilmente submetido a múltiplas sessões de imagem. Isto permite estudos longitudinais mais cursos de tempo variando de horas a dias. Este protocolo descreve passo-a-passo como preparar o chip e como utilizar o chip para imagens ao vivo de eventos neuronais no 3 º larvas. Estes eventos incluem o rápido transporte de organelas em axônios, respostas de cálcio por lesão, e os estudos de lapso de tempo do tráfico de proteínas foto-conversível em longas distâncias e escalas de tempo. Outra aplicação do chip é estudar regenerativa e respostas degenerativas lesão axonal, por isso, a segunda parte deste protocolo descreve um procedimento novo e simples para ferir axônios dentro de nervos periféricos por um esmagamento do nervo segmentar.

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Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado &quot;chip larva &#39;para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 º instar as larvas Drosophila.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

using-microfluidics-chips-for-live-imaging-study-injury-responses

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

15.4K visualizações.  University of Michigan.  Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado "chip larva 'para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 º instar as larvas Drosophila. 

Vídeo: Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Bioengenharia

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). We demonstrate in this video article how blast TBI-relevant impulsive pressurization is applied to the neuronal cells in vitro. This is achieved by using well-controlled pressure pulse created by a specialized Kolsky bar device, with complete pressure history within the cell pressurization chamber recorded. Pressurized neuronal cells are inspected immediately after pressurization, or further incubated to examine the long-term effects of impulsive pressurization on neurite/axonal outgrowth, neuronal gene expression, apoptosis, etc. We observed that impulsive pressurization at about 2 MPa induces distinct neurite loss relative to unpressurized cells. Our technique provides a novel method to investigate the molecular/cellular mechanisms of blast TBI, via impulsive pressurization of brain cells at well-controlled pressure magnitude and duration.

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate the molecular/cellular mechanisms of blast-induced traumatic brain injury.

Pressurização impulsivo de células neuronais de Estudos Traumático Brain Injury

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

Treinar Pessoas com lesão medular de deambular Usando um exoesqueleto energizado

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...