Agradecemos Chuck Scott e Victor McKnight da CBS Scientific Company Inc. ( <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> ) para assistência de engenharia e fabricação de câmara 3D, unidade de troca gasosa, e insere. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (subvenções R21DK067084 e R43CA141782 para SKK).

1. Prepare as inserções superior e inferior para o crescimento celular por colágeno Coating <ol><li> Calcular o número de inserções necessárias para o experimento. Colocar cada inserto numa caixa de Petri estéril separada (35 x 10 mm) e esterilizar por irradiação (11 Gy). </li><li> Preparar a solução de colagénio para o revestimento das membranas: 50 ug / ml, 154 ul por pastilha (inserir a área de superfície de 1,54 centímetros 2). </li><li> Coloque várias gotas (~ 20 ul por queda) de solução de colagénio num círculo sobre a superfície da membrana do elemento de inserção (não deixe que a ponta da pipeta toque na superfície) e, em seguida, adicionar cuidadosamente o resto da alíquota, para formar uma grande queda na superfície da membrana. Assegure-se que a solução de colagénio e permanece hemisférica não drena a partir da superfície da membrana. </li><li> Cobrir a placa de Petri com uma tampa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, sobre uma superfície plana. </li><li> Aspirar a solução de colagénio e lavar a membrana uma vez cobrindo com 160 ul de PBS. </li><li> Aspirate o PBS e substituir a tampa. Se você estiver usando no mesmo dia, coloque a placa de Petri em um lugar seco à temperatura ambiente. Caso contrário, colocar a cápsula a 4 ° C e utilizar a inserção dentro de 7 dias. </li></ol> 2. Cultura de células endoteliais nas inserções superiores <ol><li> Prepare suspensão CE em meio de cultura desejada. Assegure-se que a viabilidade celular é&gt; 98% e usar imediatamente. </li></ol> Nota: Para humana CE veia umbilical (HUVEC), 4 x 10 5 células em 160 mL por inserção é utilizada. <ol start="2"><li> Tome as placas de Petri com inserções de colágeno revestidas preparadas na seção 1, não remova as inserções dos pratos. Coloque várias pequenas gotas da suspensão de células (aproximadamente 20 ul por gota) em um círculo na superfície da membrana de colagénio revestido (não deixe que a ponta da pipeta toque a superfície) e, em seguida, adicionar cuidadosamente o resto da suspensão de células para formar uma gota grande. Assegure-se que a suspensão de células permanece hemis<html> pherical e não drena a partir da superfície da membrana. </li><li> Substituir as tampas e cuidadosamente colocar os pratos em 5% de CO 2 incubadora de cultura de células e incubar (sem agitação) a 37 ° C durante 30 minutos para permitir que as células fixar-se à membrana. </li><li> Com cuidado, adicionam-se 5 ml de meio de cultura de cada placa de Petri para assegurar que a pastilha permanece na parte inferior do prato e é completamente coberta pelo meio. Substituir as tampas e colocou os pratos de volta na incubadora. Cultura das células a 37 ° C durante a noite. </li><li> É a mesma abordagem para preparar a segunda mais baixa de inserção (opcional) com células representativas do microambiente local, o que vai ser colocado abaixo do inserto contendo a camada de CE. </li></ol> Nota: se as inserções mais baixas estão incluídas nas experiências, as inserções superior e inferior estão ligados um ao outro primeiro, antes de colocar as inserções no dispositivo 3D (Figura 4B). e &quot;&gt; 3. Monte o dispositivo Câmara de fluxo 3D <ol><li> Parafuso juntas as placas superior e inferior, as placas de ligação para a unidade de troca de gás utilizando tubos, colocar um dispositivo de montagem de um saco de plástico limpos, e esterilizar o conteúdo do saco e por meio de irradiação (11 Gy). </li><li> Retire a bandeja de prateleira da cultura de células incubadora, lugar em uma capa de cultura de tecido estéril, spray com etanol 70%, limpe e, em seguida, cubra a bandeja com um grande guardanapo estéril. </li><li> Coloque o saco plástico irradiado dentro do capuz, remover o dispositivo da bolsa e colocar na bandeja incubadora esterilizada. Ligue o dispositivo para a bomba peristáltica com a tubagem fornecida. Programa da bomba para uma melhor velocidade de 0,2 ml / min. </li></ol> Nota: Para ligar a bomba com a tomada de corrente eléctrica, a extrusão do fio eléctrico através do furo na parte de trás da incubadora. Utilize tampão ladrão em torno do cabo para assegurar que o orifício é vedado. <ol start="4"><li&gt; Local 5-7 ml de meio de cultura desejada num tubo de 15 ml estéril (para a &quot;entrada&quot;). </li></ol> 4. Primeiro Dispositivo Câmara de fluxo 3D <ol><li> Desligue o tubo de entrada da tomada puxando a agulha de metal a partir do tubo (usar pequenos pensos esterilizados para manter a esterilidade da tubagem). Utilize a agulha de metal ligado à tubagem como um &quot;entrada&quot; e a extremidade desligada da tubagem como uma &quot;saída&quot;. Coloque a entrada da agulha de metal no tubo de 15 ml com a mídia; colocar a saída para o tubo vazio de 15 ml. </li><li> Ligue a bomba para que o fluxo é anti-horário e definir a taxa de fluxo de 0,2 ml / min. Permitir que a pressão negativa para extrair o meio a partir do tubo de entrada de 15 ml através da tubagem e parar a bomba quando o meio chega ao fim da tubagem imediatamente antes de ele se liga ao dispositivo (Figura 2, parar # 1). </li><li> Desapertar as placas superior e inferior do dispositivo. Cuidadosamente retire a placa superior e coloque 1500 - 1550 mL de medium (ou meio sozinho ou mais das quimiocinas experimentais) nas cavidades inferiores. Certifique-se bem o meio contém suficiente para formar um hemisfério, que atinge cerca de 1 - 2 mm acima do prato inferior. </li><li> Transferir a pastilha preparada a partir da placa de Petri com os poços da placa inferior usando fórceps estéreis, certificando-se de que não há bolhas são presas entre as inserções. Aspirar todo o meio que aparece sobre a superfície da placa inferior para garantir que o prato continua a ser seco. Coloque a placa superior de volta para a placa inferior e re-conectar as placas com os parafusos. </li><li> Imediatamente ligar a bomba peristáltica e permitir que o meio a fluir através do dispositivo em 3D. Elevar a extremidade de saída do dispositivo e manter a câmara nesta posição, para evitar a formação de bolhas no interior do espaço entre as placas. </li><li> Permitir que o meio para encher a câmara e o tubo de ligação da câmara para a unidade de troca de gás. Parar a bomba imediatamente antes do meio atinge o gás eunidade xchange (Figura 2; Parar # 2). Colocar 3 ml de meio para a unidade de troca gasosa, ligar a bomba, e permitir que as bolhas de ar para escapar através da unidade de troca gasosa. Elevar a unidade de permuta de gás para permitir que o meio para encher o tubo de saída da unidade de troca de gás e parar a bomba quando o meio de atingir 2 - 3 cm, antes do fim do tubo de saída (Figura 2, parar # 3). </li><li> Conecte a agulha de metal entrada para a saída usando pequenos guardanapos estéreis. Reprogramar a bomba para o líquido escoa em direção oposta (sentido horário) em direção à unidade de troca gasosa e assegurar as bolhas de ar são removidas assim que chegar à unidade de troca gasosa. Verificar que não há bolhas de ar no sistema. </li><li> Reprogramar a bomba de modo que o meio de fluxos para a esquerda. Adicionam-se 100 ul da suspensão de células de ensaio para a unidade de permuta de gás. Fechar a tampa da unidade de permuta de gás, colocar o tabuleiro, com o sistema de trabalho de volta na incubadora, e permitir que as células de teste para cire no dispositivo 3D, a 37 ° C durante o tempo desejado. </li></ol> Nota: Limpar o cabo eléctrico da bomba com etanol a 70% e colocá-lo dentro da incubadora. 5. Terminar o teste e coletar amostras para ensaio <ol><li> Retire a bandeja com o sistema de trabalho da incubadora e coloque no capô. Parar a bomba, desligue a entrada ea saída, e colocar as extremidades em tubos de 15 ml estéreis vazios. </li><li> Ligar a bomba e recolher a suspensão de células a partir do sistema; lugar a suspensão de células sobre gelo, se necessário, até à sua utilização. </li><li> Desmonte a câmara, removendo os parafusos e levantando a placa superior. Remover as inserções a partir da placa inferior e transferi-los para placas de Petri. </li></ol> Nota: As inserções podem ser coradas para visualizar e contar as células in situ (0,05% de violeta de cristal em dH 2 O) ou tripsinizadas para recolher a CE para posteriorteste. <ol start="4"><li> Remover o meio e as células dos poços inferiores em tubos e centrifugar durante 5 minutos a 210 x g. Remover o sobrenadante, lavagem e ressuspender as células, como desejado, e processar as células de acordo com os objectivos específicos experimentais (discutido mais adiante). </li></ol>

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Cascade Life Sciences Inc. possui direitos exclusivos de patente EUA 7.927.867 B2 &quot;Dispositivo para avaliar a migração de células in vitro sob condições de fluxo e métodos para usos dos mesmos&quot;. SKK é um inventor da tecnologia dispositivo câmara de fluxo 3D e um co-fundador científico e acionista da Cascade Life Sciences Inc.

O dispositivo 3D pode ser uma tecnologia útil para a investigação em vários campos, incluindo biologia de células-tronco, biologia vascular, hematologia, oncologia, autoimunidade e inflamação. O dispositivo 3D será particularmente útil para investigadores a estudar as células-tronco hematopoiéticas, mesenquimais, neuronais e outra para investigar os mecanismos moleculares que regulam a cada passo da cascata de extravasamento de células estaminais. Pesquisadores que estudam a migração de células também pode usar este dispositivo para examinar os mecanismos migratórios diferentes de T e linfócitos B, monócitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK, e outras células migratórias. Em biologia vascular, o dispositivo irá ser útil para avaliar o efeito do microambiente local sobre a capacidade da EC para apoiar o recrutamento de células e para imitar a barreira hemato-encefálica in vitro. Para os investigadores incidindo sobre a patogênese da doença, o dispositivo pode ser utilizado para estudar a migração de células T citotóxicas no pâncreas durante a diabetes tipo I, o migração dos eosinófilos nos pulmões de pacientes com asma, a migração de neutrófilos, monócitos e linfócitos em locais de inflamação numa variedade de doenças, o recrutamento de células para locais de ferida cura, a interacção das células T citotóxicas, com a neovascularização, e recrutamento de células T citotóxicos em tumores. O novo dispositivo 3D também será uma ferramenta útil para a ciência translacional e para o desenvolvimento de drogas pré-clínica e triagem. Por exemplo, o dispositivo pode ser utilizado para optimizar a preparação de suspensões de células terapêuticas para administração intravenosa, para testar o recrutamento de células terapêuticas a tecidos lesados ​​contra tecidos normais, e para examinar o papel de órgão específico ou tecido do endotélio e neste microambiente processo. Para o desenvolvimento de medicamentos, o dispositivo pode ser usado para testar os candidatos de drogas que as células tumorais alvo e bloquear cada passo da cascata de extravasão, para testar as células que migram como uma droga proporcionamy veículo no local do tumor, para testar as drogas que regulam a função do endotélio específico do órgão humano ou o microambiente específico de tecido local, e para testar combinações de drogas que regulam diferentes passos da cascata de homing. Finalmente, quando convertido num sistema de elevado rendimento, o dispositivo pode ser usado para o rastreio de pequenas moléculas, peptídeos e anticorpos que se moléculas alvo que medeiam o tráfico de células. Detalhes técnicos e dicas Rolamento e adesão sob fluxo são os passos críticos na cascata de extravasamento e contribuem significativamente para a eficiência da migração de células in vivo. Notavelmente, estes passos não contribuem para ensaios estáticos in vitro. No entanto, os ensaios de transmigração estáticos são úteis como controlos negativos em experimentos testando os efeitos da tensão de cisalhamento em função de sobrevivência e de células, incluindo a capacidade da EC para suportar as interacções de baixa afinidade (rolamento) e de aderência firme. A escolha do meio para experiências em 3D do dispositivo é importante. Mídia conter diferentes fatores de crescimento que podem influenciar a sobrevivência de células circulantes, especialmente durante longos períodos de incubação. Além disso, as concentrações de Ca 2 + e Mg 2 +, o que pode influenciar as interacções adesivas sob condições de fluxo fisiológico, variar consideravelmente em meios de cultura comercial. Outros detalhes técnicos que devem ser levados em conta no planejamento de experimentos com o dispositivo 3D são discutidas abaixo. Selecção da monocamada CE A assinatura do CE da superfície celular é influenciado por vários parâmetros, incluindo a espécie e tecido de origem e as condições de cultura de células, que deverão ser tomados em consideração na concepção experimental. Alguns CE normalmente utilizados incluem pulmão derivado microvascular CE (LDMVEC), derivadas de medula óssea CE (BMDEC), derivado do cérebro CE (BDEC) e HUVEC.As propriedades do CE também variam com a sua origem. Por exemplo, BMDEC expressam constitutivamente selectinas e VCAM-1, que são responsáveis ​​por laminagem e a adesão, ao passo que BDEC, LDMVEC, e HUVEC não expressam estas moléculas em condições normais. Portanto, inserções revestidas com BDEC, LDMVEC, e HUVEC podem ser pré-tratadas com TNF α (10 ng / mL, 4 horas) ou de outros factores imitam a inflamação e induzir a expressão de moléculas de homing. Testando interferência com o microambiente local, Há um interesse crescente na compreensão de como o microambiente local, regula as funções do CE e participa de extravasamento celular. Os nossos resultados demonstram que a inserção de uma monocamada de células estromais, sob a monocamada CE aumenta significativamente o extravasamento de células circulantes. Essa constatação demonstra que a interferência entre CE e estroma aumenta a capacidade da CE para apoiar extravasamento de células circulantes. Moreover, a inserção de células de diferentes microambientes (por exemplo, células estaminais mesenquimais, f ibroblastos, células de tumor de pulmão, astrócitos) podem contribuir para imitar leitos vasculares específicos. Em particular, uma combinação de derivado do cérebro CE e astrócitos poderia ser uma abordagem útil para imitar a barreira sangue-cérebro. Do mesmo modo, as células obtidas a partir de pacientes ou células normais manipuladas in vitro, pode ajudar a imitar um microambiente doente específico. Nos nossos estudos, utilizou-se pastilhas mais baixos com as células do estroma cultivadas a 50% de confluência. Embora a densidade óptima de células micro-ambientais para as inserções dependerá dos objectivos do estudo, o que pode ser facilmente manipulada e controlada. Seleção de uma taxa de tensão de cisalhamento A tensão de corte de 0,8 dines / cm 2 foi usado aqui, porque isso tem sido demonstrado por Von Andrian et ai. ser a tensão de cisalhamento na microvasculatur medula ósseae, em que as células progenitoras hematopoiéticas sair da circulação e entrar nos tecidos sob condições fisiológicas normais 15. Em contraste, os níveis mais altos de tensão de corte são observados em navios maiores, onde o extravasamento de células é limitado. Por conseguinte, as elevadas taxas de cisalhamento podem ser utilizados como controlos adicionais para experiências examinando o extravasamento de vários tipos de células. A sobrevivência das células sob tensão de cisalhamento depende de vários fatores, incluindo o tipo de célula e os tratamentos com células ex vivo (Goncharova et al., Observações não publicadas), e deve, portanto, ser cuidadosamente avaliados durante o teste. Sensibilidade celular a diferentes níveis de tensão de cisalhamento (shear stress resistência) pode ser avaliada por meio da programação da bomba peristáltica, para aumentar a taxa de tensão de cisalhamento em incrementos de 0,8 dines / cm 2 a 6 dines / cm 2. Durante estes testes, as células podem ser recolhidos periodicamente a partir da câmara de permuta de gás para controlar a morte celular utilizando comodiz tais como exclusão de azul de tripano, a anexina V e coloração PI, e a expressão do marcador de apoptose. Se as experiências foram concebidas para testar a resistência à tensão de cisalhamento de células manipuladas ex vivo ou células derivadas de parênquima, recomenda-se que os controlos positivos adicionais, tais como células de sangue suportados, estão incluídos nas experiências. A selecção do tamanho dos poros da pastilha e revestimento de ECM Insere estão disponíveis com vários tamanhos de poro (3, 5 e 8 mm). A escolha do tamanho dos poros vai depender do tamanho e propriedades das células circulantes teste, que também é o caso para os ensaios estáticos Transwell. As inserções com um tamanho de poro grande (8 um) são recomendados para testar o extravasamento de grandes células, tais como células tumorais de origem epitelial. Leucócitos ou células-tronco hematopoiéticas são mais comumente testado com cinco inserções de poros mM e 3 mM insere poros são mais reservados para testar extravasamento de scélulas maller. No entanto, o tamanho da célula de ensaio por si só não é o único factor importante e recomendamos testar pastilhas com várias dimensões de poros. Em nossos estudos iniciais, testamos vários ECM por sua capacidade de suportar o crescimento da CE sobre as inserções e para resistir a tensão de cisalhamento para&gt; 4 hr. O ECM testadas incluíram Matrigel, poli-D-lisina, fibronectina, laminina, colagénio do tipo I, hidrogel, Meta-queratina I, II, III, IV, e extracelular. Os melhores resultados para o crescimento do CE foram obtidos com extracelular, fibronectina e colagénio. No entanto, nas nossas mãos, extracelular de 0,8 ug / cm 2, reduziu significativamente a transmigração de células de teste através da membrana. Por isso, agora utilizam fibronectina (5 ug / cm 2) ou colagénio (5 mg / cm 2) para o revestimento de pastilhas. No entanto, a escolha óptima da ECM serão provavelmente influenciados pelo tipo de CE Transmigratory e as propriedades das células de ensaio. A experiência preliminar deve ser realizada para testar a integrity da monocamada de EC cultivadas em ECM seleccionado. Por exemplo, colocar insertos pré-revestidas com monocamadas EC em pratos de Petri cheia de meio de cultura, colocar os pratos num agitador para criar tensões de cisalhamento (ajuste baixo), e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 12 horas. A integridade do EC após a exposição ao stress de cisalhamento pode ser avaliada utilizando coloração com violeta de cristal. Seleção de concentrações de células de teste ideais A capacidade das células de teste para a circulação sair depende de muitas características específicas de cada tipo de célula. Para gerar resultados estatisticamente significativos, a densidade de células circulantes tem de ser optimizada para garantir que um número suficiente de células migram para os poços de controlo positivo. Portanto, recomendamos a realização de testes iniciais com uma gama de densidades celulares (por exemplo, 10 3 / ml a 10 7 / ml) para se entender a relação entre o número de células carregado no sistema eo número de células que sofrem a transmigração. Além disso, a concentração óptima de circulação podem ser diferentes para o mesmo tipo de célula obtido a partir de fontes diferentes. Por exemplo, as células CD34 + são uma população celular heterogénea contendo ambas as células estaminais hematopoiéticas e progenitoras comprometidas específicos de linhagem. Elas podem ser obtidas a partir de medula óssea, sangue periférico mobilizado e sangue de cordão umbilical. As células CD34 + derivadas destas três fontes possuem diferentes capacidades de direcção e enxertando 16-18, de modo a testar as condições para estas células no dispositivo 3D deve ser optimizado antes de um estudo de escala completa. Selecção do tempo de circulação celular ideal O tempo de circulação ideal deve ser determinada empiricamente para cada tipo de célula. O tempo mínimo necessário para a circulação pode ser extrapolada a partir dos resultados dos ensaios de migração estáticos, mas isto pode ser extended quando as células são submetidas a tensão de cisalhamento. Estudos-piloto de testes tempos de circulação entre 4 e 96 horas são recomendados. A unidade de permuta de gás A finalidade principal da unidade de permuta de gás é manter a concentração óptima de CO 2 no meio que circula através do dispositivo 3D, semelhante às configurações em incubadoras de cultura de tecidos padrão. A unidade de troca de gás pode também ser utilizada para a adição de células de teste e os compostos e para a recolha de amostras de sondas e durante o ensaio. Avaliação do número de células de teste Células circulantes podem ser amostrados em momentos diferentes durante a experiência por meio da unidade de troca de gás. No final do experimento, as células restantes na circulação poderia ser coletadas a partir da tomada. Quando o dispositivo é desmontado 3D, no final da experiência, as células transmigrou pode ser colhida a partir dos poços inferiores e recolhido fou análise posterior. Se as células de entrada são sem rótulo, as células transmigrou pode ser manchado com azul de tripano e células vivas / mortas enumerados microscopicamente. Alternativamente, as células de entrada poderia ser rotulado com um dos muitos &quot;célula&quot; rastreadores corantes disponíveis para imagens de células vivas antes do carregamento para o dispositivo 3D, neste caso, o transmigrou colhidas células devem ser lisadas para a quantificação de fluorescência. A selecção do tamanho da amostra óptima Para permitir uma análise estatística, um tamanho de amostra deve ser seleccionado que irá proporcionar aproximadamente 80% de potência para detectar uma diferença hipotética nas alterações percentuais médias entre os dois grupos, quando testados a um nível de significância de 0,05 usando um teste t de duas faces. Com base na experiência com as células de medula óssea, utilizam-se três poços por condição experimental para os experimentos de dispositivo 3D. No entanto, o tamanho da amostra óptima variará de acordo com o objectivo da experiência e deve ser determinada empirically. Vários testes estatísticos de regressão, testes t de duas faces, e as análises de variação pode ser utilizada para verificar a relevância estatística dos resultados. Selecção das quimiocinas Tal como para todos os ensaios de transmigração, a escolha do quimioatractor será ditada pelas propriedades das células de teste e com o objectivo do estudo. SDF-1 é um quimioatractor bem estabelecido para as células hematopoiéticas. Nas nossas mãos, uma concentração de 50 ng / ml de SDF-1 era óptima para estimular o extravasamento de osso células progenitoras hematopoiéticas derivadas de medula. Nós também usamos C3a e bFGF como chemoattractants para células-tronco mesenquimais 19. No entanto, recomendamos titulação de cada um de quimiocinas e cross-titulação combinações de quimiocinas para identificar a faixa de concentração ideal antes de um estudo em grande escala. Para certos tipos de células, uma combinação de factores quimiotáticos pode ser benéfica. Se quimiocinas para células de teste específicos são desconhecidos ou não disponíveis, conditioned meios de linfócitos estimulados, os fibroblastos e outras células podem ser usadas como fonte de agentes quimioatractivos. Selecção dos parâmetros de leitura A versatilidade do dispositivo 3D irá expandir o tipo de experiências de transmigração que podem ser executadas, eo sucesso das experiências dependerá consideração pensativa e design dos parâmetros de leitura. Como regra, as células recolhidas a partir do compartimento superior (circulante) e o compartimento inferior (estático) devem ser testadas para a viabilidade ao mesmo tempo que a contagem das células. Algumas células possuem baixa tolerância à tensão de corte fisiológicas observadas na microvasculatura. Neste caso, o número de células mortas será aumentada no compartimento superior. O número de células aderentes presos (ou preso) na camada de CE, pode ser avaliado pela imunocitoquímica de marcadores expressos especificamente nas células de ensaio. Os anticorpos específicos para CD31 e vWF pode ser utilizadaCE para detectar e para permitir a discriminação entre as células de teste e EC. Além disso, a integridade da monocamada de CE deve ser controlada no final de cada teste. Os tipos de análises realizadas com as células coletadas dependerá objetivos experimentais dos investigadores, mas podem incluir análise de mudanças na expressão gênica por microarrays e qPCR, a expressão de moléculas de superfície por meio de análise FACS, a ativação de vias de sinalização por FACS e Western blotting, e fator de secreção por ELISA. Uma enorme variedade de testes funcionais são possíveis nas células recolhidas in vitro, tal como evidenciado pelo nosso próprio trabalho, no qual as células de cultura de medula óssea transmigrou para enumerar as células progenitoras hematopoiéticas (Figura 3). As amostras também podem ser testados em uma variedade de ensaios in vivo. Um parâmetro importante que pode ajudar a prever o comportamento das células de teste in vivo é a tendênciacia de algumas células para formar agregados sob diferentes taxas de cisalhamento. Por exemplo, células terapêuticas que se submetem a formação de agregados no dispositivo 3D pode ter uma maior tendência para formar grumos após a administração intravenosa e causar obstrução vascular aguda in vivo (Goncharova et ai., Observações não publicadas). A formação de agregados pode ser monitorizada por amostragem microscopicamente as células de teste durante ou após a conclusão do experimento dispositivo 3D.

Extravasão celular é o processo pelo qual as células circulantes sair na corrente sanguínea e é um componente essencial de muitas respostas fisiológicas no corpo. O processo também é importante para a regeneração de tecidos, como, por exemplo, quando as células terapêuticas mobilizados a partir de tecidos dentro dos vasos sanguíneos (ou injectado por via intravenosa) migram através da vasculatura e sair da circulação para locais de lesão ou degeneração. Extravasão também é um componente crítico na patogénese de muitas doenças, incluindo a inflamação, rejeição imunológica, auto-imunidade, e metástases de tumores. A extravasão é um processo multi-passo complexo que envolve a interacção de células com células endoteliais (CE) circula em condições de fluxo fisiológico. O processo compreende (a) laminação de células, (b), adesão firme para a superfície luminal do CE, e (c), a transmigração através da CE. Importante, a cada passo da cascata de extravasamento é regulada por um subconjunto de cell específico do tipo e moléculas específicas das espécies. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a execução extravasamento de subconjuntos específicos de células não são bem compreendidos, em grande parte, devido à dificuldade técnica de recapitulando as condições na corrente sanguínea. O novo dispositivo 3D descrito aqui é projetado para superar estes desafios técnicos e permitir experimentos a serem realizados que vão melhorar a nossa compreensão da biologia da migração celular. As moléculas que medeiam a migração de células são alvos terapêuticos importantes. Um conhecimento pormenorizado dos acontecimentos moleculares que controlam a migração de tipos de células específicas possam ajudar a identificar novos alvos para a promoção terapêutico ou inibição de extravasamento. Por exemplo, as intervenções que aumentam a migração de células estaminais terapêuticos (mesmo derivado de adulto, neonatal ou mesmo a partir de tecidos fetais) para locais de lesão ou degeneração seria de grande utilidade na regeneração do tecido.Há um interesse crescente na geração in vitro de células estaminais terapêuticos, incluindo células derivadas a partir de fontes pluripotentes, e em células manipuladas ex vivo estaminais adultas (expandida, geneticamente manipulado, e pré-tratado com várias enzimas) 1. Assim, existe uma necessidade de novas tecnologias para avaliar a qualidade das células estaminais, antes de serem utilizadas para fins terapêuticos. Entre outros parâmetros, as células devem ser capazes de eficientemente sair da circulação, pois os tratamentos para distúrbios multifocais podem exigir a administração intravenosa das células estaminais 2. De fato, um dos desafios atuais em biologia de células-tronco é superar a baixíssima eficiência com que as células-tronco casa para os locais de dano tecidual 3-6, destacando a necessidade de abordar esta lacuna em nossa compreensão da migração de células-tronco. Em contraste, as estratégias que a migração de células bloco alvejando homing moléculas específicas seria útil para o tratamento de, emdoenças inflamatórias e auto-imunes, assim como o cancro metastático. Assim, a compreensão dos mecanismos moleculares que mediam as interações entre células circulantes e da CE durante a migração celular e extravasamento é relevante para a medicina translacional e descoberta de drogas, bem como a ciência básica. Existem actualmente uma série de métodos disponíveis para estudar os diferentes aspectos da migração das células. No entanto, estes métodos têm limitações que podem ser superados com o novo dispositivo 3D. Os modelos animais: Os modelos animais, tais como ratinhos e ratos imunocomprometidos geneticamente manipulados, têm sido ferramentas úteis para estudar a migração de células humanas in vivo. No entanto, uma desvantagem significativa destes modelos é que as células humanas interagem fracamente com as moléculas de adesão presentes na CE rato, em parte devido a diferenças de sequência específicos para a espécie em muitas moléculas da superfície celular. Assim, o uso de roedores para estudarmigração de células humanas é improvável que autenticamente reflectir os eventos em leitos vasculares específicas de órgãos humanos. Além disso, em modelos in vivo, não são adequados para o rastreio de alto rendimento de candidatos a fármacos. O convencional em modelos in vivo, utilizando para estudar célula homing não discriminar entre os diferentes passos da cascata de extravasamento, tornando-se difícil identificar e alvejar moléculas homing novos. Foi desenvolvido a abordagem microscopia intravital para atender a essa necessidade e tem sido informativo, no entanto, esta técnica é extremamente tempo e mão de obra intensiva 7,8. Os ensaios estáticos de transmigração: Transwell ou câmara de Boyden ensaios de migração de células de medida através de uma membrana porosa e são amplamente utilizados em estudos de migração. O ensaio tem a vantagem de que ele pode ser usado não só para estudar a motilidade celular e da matriz (ECM) interacções célula-extracelular, mas também a migração mediada por quimioquina de célulasatravés de uma monocamada de EC cultivadas sobre as membranas porosas. Infelizmente, o fenótipo e função do CE em condições estáticas diferem significativamente daqueles sob fluxo fisiológico 9,10. Assim, os eventos quimiotáticos que ocorrem nos ensaios Transwell não imitar fielmente as interações entre células migram e CE sob tensão de cisalhamento. Além disso, o passo de &quot;rolling&quot; da cascata da direcção, o que adiciona uma dimensão adicional de selectividade para o processo global, não ocorre em ensaios estáticos Transwell. Assim, embora esta tecnologia não permite a avaliação quantitativa da migração celular mediada por quimiocina em toda a monocamada de CE, que é limitada pela sua incapacidade de fornecer a tensão de cisalhamento que imita o fluxo de sangue in vivo. Ensaios sob tensão de cisalhamento: O stress da parede de corte é conhecida por desempenhar um papel importante na regulação da função CE 9,10. Forças de cisalhamento induzir a ativação rápida de cascatas de sinalização, transcfatores ription e expressão diferencial de genes em EC 11,12. Esta informação conduziu ao desenvolvimento de uma nova geração de ensaios de adesão - câmaras de fluxo laminar e capilares paralelas - estudar rolar e a adesão das células à CE, em condições de tensão de corte 7,13. O fator limitante para esses testes é que eles podem medir apenas de rolamento e aderência, mas não diferenciar entre uma célula aderente que iria passar a transmigrar e uma célula aderente que está &quot;preso&quot; na monocamada CE e não transmigrar. Além disso, estes ensaios não é possível medir a migração de células em relação a um gradiente de quimiocina. Vários estudos têm descrito a capacidade de células aderentes a rastejar sob uma monocamada CE crescido em lâminas de vidro, em condições de fluxo 14. As limitações para esta técnica rastejando incluem: analisa apenas um número limitado de células, que é não-quantitativa, analisa célula rastejar sobre a matriz e cell superfície, mas não para a migração de um gradiente quimiotáctica, e que não permite que as células transmigrou a ser isolado. Assim, embora este teste tem a vantagem de aplicar tensão de corte para a monocamada de CE, não pode quantificar a migração das células em relação a um gradiente de quimiocina. A nova tecnologia de 3D ​​aqui descrito supera muitas destas deficiências por combinação da força de cisalhamento (compartimento superior) com um gradiente de quimiocina estático (compartimento inferior), e permite a avaliação quantitativa de cada passo da cascata de extravasamento (Figura 1). O dispositivo também pode ser utilizado para investigar a forma como a interferência entre CE e o microambiente influencia a capacidade da EC para apoiar o extravasamento de células circulantes. O protocolo seguinte descreve a metodologia passo-a-passo para o uso do dispositivo de câmara de fluxo 3D.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>981.0142.000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3D Chamber</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FC-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gas exchange unit</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inserts</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCI-1005U</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen Bovine,Type I</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354231</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid 0.1M</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BDH3200-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HUVEC</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC- 2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 &#38; cc - 4133)</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC - 3124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDF-1</td>
 <td>R7D System</td>
 <td>460-SD</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extracel Trial 2.5 Kit</td>
 <td>Glycosam Byosystems</td>
 <td>GS211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibronectin, human , nature</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>356008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>A-003-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BD Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354277</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>7050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF-alfa, 10 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHC3015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC</td>
 <td>Southern Bioteck</td>
 <td>9519-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td># 556463</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>CB007F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>Zenbio</td>
 <td>SER - CD34-F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MethoCult GF M3434</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>GFM3434</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse Methylcellulose complete media</td>
 <td>R&#38;D</td>
 <td>HSC007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Von Willibrand Factor antibody</td>
 <td>abcam</td>
 <td>C# ab11713</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petry dish (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA25373-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>VWR Fisher</td>
 <td>21008 - 918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flasks 75cm2</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BD353136</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cristal violet</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C-3886-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting forceps, curved</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-384</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,000 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>83007-380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 - 200 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>37001-530</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>403U/VM3</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a novel three-dimensional flow chamber device to study chemokine-directed extravasation of cells circulating under physiological flow conditions

O extravasamento de células a partir da circulação sanguínea desempenha um papel central em muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo células estaminais homing e metástase do tumor. O dispositivo de câmara de fluxo tridimensional (doravante o dispositivo 3D) é uma nova tecnologia in vitro que recria a tensão de corte fisiológicas e permite que cada passo da cascata de extravasamento de células a ser quantificado. O dispositivo consiste em 3D de um compartimento superior, em que as células de interesse circular sob tensão de corte, e um compartimento inferior de poços estáticos que contêm os quimioatractores de interesse. Os dois compartimentos são separados por inserções porosos revestidos com uma monocamada de células endoteliais (CE). Uma segunda inserção opcional com células do microambiente de interesse pode ser colocada imediatamente abaixo da camada CE. A unidade de permuta de gás permite que a tensão óptima de CO 2 para ser mantido e proporciona um ponto de acesso para adicionar ou retirar células ou de compostos durante oexperimento. As células de teste circular no compartimento superior à tensão de cisalhamento desejada (taxa de fluxo) controlado por uma bomba peristáltica. No final da experiência, as células circulantes e migraram são recolhidos para mais análises. O dispositivo 3D pode ser usado para examinar célula rolando e adesão à CE sob tensão de cisalhamento, transmigração em resposta a gradientes de quimiocinas, a resistência à tensão de corte, formação de aglomerados, a sobrevivência celular. Além disso, a segunda inserção opcional permite que os efeitos de interferência entre CE e as células micro-ambientais para ser examinada. As aplicações de translação do dispositivo de 3D ​​incluir testes de candidatos a fármacos de que a migração de células alvo e predizer o comportamento in vivo de células após a injecção intravenosa. Assim, o novo dispositivo de 3D é uma ferramenta versátil e barato para estudar os mecanismos moleculares que medeiam a extravasão celular.

O óssea de camundongos linha CE derivadas da medula STR-12 foi cultivada em pastilhas com 5 mM poros. A taxa de crescimento CE foi monitorizado sob um microscópio, e quando a CE foram de 100% confluentes, as inserções foram transferidas para os poços do compartimento inferior do dispositivo 3D. Imediatamente antes de colocar as inserções, os poços do compartimento inferior foram preenchidos com meio de cultura por si só (controlo negativo) ou com meio de cultura suplementado com estromal derivada de células factor-1 (SDF-1, 5 ng / ml e 50 ng / ml). Depois disso, o dispositivo foi montado em 3D e a câmara foi preenchida com o meio, tal como descrito no protocolo. As células de teste para ser circulado no compartimento superior do aparelho foram colhidas células de medula óssea de murino (3,5 x 10 6 culas por câmara). Uma tensão de cisalhamento definida de 0,8 dines / cm 2 foi aplicado ajustando a velocidade da bomba peristáltica, a 0,2 ml / min. O funcionamento do sistema inteiro foi depois colocado no 5% incubadora de CO 2 a 37 ° C e a cells foram autorizados a circular e interagir com a monocamada CE durante 4 horas. No final deste tempo, as células circulantes foram recolhidas, a câmara foi desmontada e os insertos foram removidos tal como descrito no protocolo. As células foram colhidas transmigrou dos poços inferiores, lavadas, ressuspensas em meio fresco e transferidas para culturas de metilcelulose suplementado com factores de crescimento hematopoiético para células (CFC), ensaio de formação de colónias (Figura 3). Como esperado, observou-se um número significativamente maior de CFC tinha migrado através da monocamada CE aos poços contendo 50 ng / ml de SDF-1 do que a poços contendo 5 ng / ml, SDF-1 ou meio sozinho. Como descrito anteriormente, nenhuma das actuais técnicas in vitro disponíveis para estudar a migração de células são capazes de testar o efeito do microambiente local sobre a capacidade da EC para apoiar o extravasamento de células migratórias. Para ilustrar a forma como isso pode ser conseguido com o dispositivo 3D, nósextravasamento examinados de células hematopoiéticas de circulação através de uma camada de CE, e uma camada de células estromais de medula óssea. Para isso, um segundo encaixe (inferior) contendo uma camada de células estromais, justaposta à inserção superior contendo a monocamada de CE na placa inferior (Figura 4). A experiência foi então efectuada tal como descrito acima e as células foram colhidas transmigrou dos poços e contadas. Os resultados demonstraram que a inserção de uma camada adicional de células estromais, sob a monocamada CE aumentou significativamente a migração de células hematopoiéticas em relação a SDF-1 (Figura 4). Esta constatação é consistente com a noção de que o microambiente local contribui para o recrutamento de células circulantes para o tecido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. O dispositivo de câmara de fluxo 3D. R: O dispositivo hermeticamente selado 3D consiste em dois compartimentos separados por uma membrana porosa substituível (PM). CE são cultivadas sobre a membrana, o qual forma uma barreira entre os compartimentos superior e inferior. Definidas as tensões de cisalhamento são aplicados ao compartimento superior do dispositivo 3D por meio de perfusão, utilizando uma bomba peristáltica de infusão constante. Células circulantes são ou não interagindo (NIC), interagir com a CE transitoriamente (&#39;roll&#39;, RC), ou aderir ao EC (AC). Uma subpopulação de células aderentes transmigra através da camada de CE para o compartimento inferior estática do dispositivo (TM), B:. Um desenho vista superior (painel superior) do dispositivo 3D. A vista em corte horizontal (painel inferior) mostra a posição da membrana superior (vermelha), a membrana inferior (verde), e a parte inferior do poço (azul) C:. O isometric vista ilustra as partes integrantes do dispositivo: quatro parafusos, um bloco de acrílico topo, um selo câmara superior, superior e membranas inferiores, fundo o-ring e um 3-bem bloco inferior acrílico D:. Uma fotografia do fluxo 3D câmara ligada a uma bomba peristáltica e uma unidade de troca de gás. O sistema é montado numa câmara estéril e depois transferida para um incubador de cultura de células. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> Figura 2. Uma representação esquemática do sistema do dispositivo 3D. O desenho mostra as três paragens necessárias para a montagem do sistema. O meio de cultura é aspirado a partir da entrada pela pressão negativa criada pela bomba peristáltica. O fluxo de meio é desligado por parar # 1 para permitir que as pastilhas sejam colocados dentro do dispositivo. Depois de a câmara está fechada, a bomba é switched novamente e a câmara é imediatamente cheia com o fluido para evitar a secagem das células cultivadas sobre as inserções. Parar # 2 permite meio a ser colocada na unidade de permuta de gás. Parar # 3 permite que o fluxo de ser parado para a ligação de entrada e saída. O fluxo pode ser dirigida no sentido horário ou anti-horário para remover as bolhas de ar através da unidade de troca de gás por meio de um interruptor na bomba. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> Figura 3. O dispositivo 3D suporta transmigração SDF-1 mediada por células progenitoras hematopoiéticas, em condições de tensão de corte fisiológicas. A: Três dispositivos (cada uma contendo três poços no compartimento inferior) foram montados e executados em paralelo. Meio sozinho ou meio contendo SDF-1 a 5 ou 50 ng / ml foi adicionada aos poços do compartimento inferior. Murino boAs células da medula ne foram autorizados a circular nos aparelhos de 4 horas. Posteriormente, cada dispositivo foi desmontado e as células que haviam transmigrou para SDF-1 (amarelo) foram colhidos a partir dos poços inferiores, contadas e cultivadas em metilcelulose suplementado com factores de crescimento hematopoiéticos (GF). Quatorze dias depois, as colónias foram classificadas sob o microscópio B:. O número de progenitores (células formadoras de colónias, CFC) recuperado dos compartimentos inferiores é mostrada como a média ± DP de três poços para cada condição. * P &lt;0,05. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> Figura 4. O efeito do microambiente sobre as interacções entre as células hematopoiéticas e células endoteliais. A: A ilustração mostra a posição de uma segunda membrana porosa com São cultafibroblastos romal (SF) debaixo da membrana superior com CE. Outras abreviaturas são tal como descrito para a Figura 1A B:.. A membrana adicional (inferior a inserção) com SF cultivadas foi inserido sob a membrana superior C: Três dispositivos (cada uma contendo três poços) foram corridos em paralelo. Meio sozinho ou meio contendo SDF-1 a 50 ng / ml de SDF-1 foram adicionados aos poços do compartimento inferior. As câmaras de controlo negativo omitido SC, SDF-1 ou ambos. Células da medula óssea foram autorizados a circular durante 4 horas a 37 ° C. Depois disso, cada dispositivo foi desmontado e as células foram recolhidas a partir de transmigrou os poços do compartimento inferior e contadas. O número de células recuperadas transmigrou é mostrada como a média ± DP de três poços para cada condição. * P &lt;0,05.

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A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

O dispositivo de câmara de fluxo tridimensional é a novel<em&gt; In vitro</em&gt; Tecnologia para a avaliação quantitativa e passo a passo da cascata de extravasamento de células circulantes em condições de tensão de cisalhamento fisiológica. Assim, o dispositivo atende a uma necessidade fundamental para os estudos básicos, pré-clínicos e clínicos de migração celular.

Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K visualizações.  Torrey Pines Institute for Molecular Studies. O dispositivo de câmara de fluxo tridimensional é a novel In vitro Tecnologia para a avaliação quantitativa e passo a passo da cascata de extravasamento de células circulantes em condições de tensão de cisalhamento fisiológica. Assim, o dispositivo atende a uma necessidade fundamental para os estudos básicos, pré-clínicos e clínicos de migração celular.

Vídeo: A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Bioengenharia

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impressão de planar e tridimensional de tintas condutoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigando a separação de fluxo tridimensional induzida por um polip de dobra vocal modelo

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...