O financiamento foi fornecido pelo NIH concede 5T32CA09216-26 (para JSB), e K01 AR055619-01A1 e 3 K01 AR055619-03S1 (para DML), bem como pelo Alex Lemonade Stand Foundation, a Harvard Stem Cell Institute ea American Cancer sociedade.

1. Microinjeção de DNA de embriões zebrafish <ol><li> Linearizar RAG2:: cMyc e RAG2:: GFP 11 construções de DNA através da digestão 10μg de cada plasmídeo com NotI a 37 ° C durante a noite. </li><li> Fenol: clorofórmio e extrair precipitar os plasmídeos, e ressuspender cada um em 20μL H 2 O. </li><li> Determinar a concentração do DNA, executando uma diluição de 1:1, 1:5 e 1:10 de cada plasmídeo digerido em um gel de agarose 1% com 20μL, 10μL e 5μL de uma escada de DNA de alta gama. Este tipo de quantificação é geralmente mais preciso do que uma leitura espectrômetro. </li><li> Diluir o DNA para uma concentração final de 1M KCl 60ng/μL em 0,5 X TE para injeção em CG1-deformação (ou tensão singeneicos outros) utilizando embriões zebrafish 30ng/μL RAG2:: cMyc + 30ng/μL RAG2:: GFP. </li><li> Injecções devem ser realizados como demonstrado anteriormente 12, 13. Resumidamente, peixe-zebra macho e fêmea são criados em câmaras de acasalamento a noite antes da injeção. No dia da injeção, o DNA é carregado para dentro da agulha de injeção, a pressão é ajustado para que uma bolha com um diâmetro de 50 ìm é expelido (30pg de DNA), que é medido por um micrômetro palco. Então, os embriões são injetados na fase de uma célula, com o DNA injetado diretamente no celular, e não para dentro da gema. Sobrevivência dos embriões injetados CG1 e larvas é geralmente pobre, e apenas 5% dos peixes com sucesso incorporar o transgene, assim,&gt; 600 embriões deve ser injetado para garantir que alguns peixes vão desenvolver leucemia. </li><li> Armazenar os embriões injetados em 28,5 ° C, e remover os embriões mortos após 24 horas. Os animais são então transferidos para grandes tanques em 5 dias de vida e criado como descrito anteriormente 14. </li></ol> 2. Triagem para T-ALL primária em larvas do peixe <ol><li> Aproximadamente 28 dias após a injeção, anestesiar zebrafish larval adicionando 200μL de 4ng / m Tricane-S de 25 ml de água do sistema de peixe em um prato de petri. </li><li> Examine as larvas para o desenvolvimento de fluorescência marcado T-ALL usando um microscópio de epifluorescência, com ampliação de 20x, usando um comprimento de onda de excitação e emissão 485/20 530/25 filtro para detectar GFP de fluorescência (Figura 1). </li><li> Larvas tumor separados positiva daqueles que são negativos. Larvas negativas podem ser examinados em um ponto mais tarde, uma vez que tumores podem ter crescido maiores, para garantir que nenhum T-Todos os peixes positivos foram perdidas. </li><li> Monitorar T-Todos os peixes positiva, pelo menos uma vez por semana usando o microscópio de epifluorescência, para acompanhar o crescimento do tumor. </li></ol> 3. Isolamento e purificação de fluorescência marcado com células de leucemia primária <ol><li> Quando as células GFP positivas leucemia têm ultrapassado&gt; 50% do animal, o sacrifício dos peixes, adicionando 1 ml de 4ng/ml Tricane-S numa placa de Petri contendo 9ml de água do sistema de peixe. </li><li> Coloque o peixe em um prato de petri contendo 1mL nova 0.9x PBS com soro bovino 5% Fetal para tamponar as células. Macerar o peixe com uma pipeta de lâmina de barbear, a mistura de dissociar aglomerados de grandes células, as células passam então por uma peneira de malha 40μm em um tubo de 50 mL. Não é necessário dissociar todos os aglomerados de tecido em células individuais. </li><li> 500μL pipeta das células para um tubo de poliestireno 4mL. Adicionar 1μL 1mg/mL iodeto de propídio (PI), que será rótulo células mortas. Vortex, em seguida, manter as células no gelo. </li><li> Sacrificar um tipo selvagem CG1 peixes, macerar e tensão da mesma forma como acima para coletar as células normais, que servem como um suporte para as células do tumor durante transplant.Add 4mL 5% FBS em 0.9x PBS ao tubo de 50 ml para um total volume de 5 mL. </li><li> Contar as células normais, diluir a 3x10 5 células / mL em 5% FBS em 0.9x PBS, então 100μL/well pipeta de uma placa de 96 poços. </li><li> Utilizando um classificador de fluorescência celular Ativado (FACS), sort GFP positivas, PI células tumorais negativa (Figura 2A, B) para a placa de 96 poços contendo células do sangue com as seguintes doses: 10 células / poço em 48 poços, 100 células / poço em 24 poços, 1.000 células / poço em 12 poços, e 10.000 células / poço em 6 poços. Além disso, 10.000 células devem ser classificados em um poço sem células sanguíneas normais, e novamente analisadas utilizando FACS para avaliar a pureza e viabilidade das células classificadas (Figura 2C). </li></ol> 4. Limitando o transplante de diluição em peixe-zebra adulto <ol><li> Agregar as células por centrifugação a placa de 96 poços na 2000xg por 10 minutos. </li><li> Remover 95μL do sobrenadante e ressuspender as células do 5μL restantes. </li><li> Segure um adulto (&gt; 60 dias) singeneicos lado zebrafish ventral para cima, e injetar a suspensão de células para a cavidade peritoneal, utilizando um 26G / 2 &quot;micro-seringa. Peixe-zebra não tem que ser anestesiado antes do transplante. Tipicamente, 45 peixes são transplantadas com 10 células de leucemia, 20 são transplantados com 100 células, 7 são transplantadas com 1.000 células e 5 peixes são transplantadas com 10.000 T-ALL células. </li></ol> 5. Análise para determinar leucemia, iniciando freqüência de células <ol><li> Aproximadamente 28 dias após o transplante, examine o peixe transplantado com um microscópio epifluoresence usando um comprimento de onda de excitação e emissão 485/20 530/25 filtro para detectar GFP fluorescência. Registrar o número de peixes positiva por número total de peixes injetados. </li><li> Reexaminar os peixes a cada 14 dias para até 90 dias e anote o número de peixes positivo. Quando um peixe tumor positivo se moribunda, o sacrifício do animal por Tricane-S overdose. </li><li> De entrada os resultados em uma tabela, como mostrado na figura 3D. Carregar os dados no ELDA web-based (Análise de Diluição de extrema limitação) software estatístico a <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, que usa a freqüência de tumor animais positivos e negativos em cada dose de transplantes para determinar a freqüência de auto-renovação de células de leucemia dentro do principal T-ALL. </li></ol> 6. Resultados representativos: Microinjeção de DNA em embriões de peixe singeneicos muitas vezes resulta em uma baixa taxa de sobrevivência dos embriões injetados, com &lt;60% dos embriões sobrevivem por 24 horas. Além disso, a sobrevivência dos peixes injetados singeneicos é geralmente pobre durante o desenvolvimento larval, com freqüência &lt;20% sobrevivem por 28 dias. Portanto, é importante para injetar um grande número de embriões a fim de criar peixes transgénicos que irá desenvolver-T ALL. Como exemplo, CG1 embriões foram injetados com tensão RAG2:: cMyc + RAG2:: GFP. Os transgenes co-segregar no embrião em desenvolvimento, de modo que cada célula que expressa GFP também expressar cMyc. As larvas foram selecionados para primário T-ALL após 28 dias (Figura 1). Os trabalhos anteriores mostraram que aproximadamente 5% dos peixes injetados terá GFP-T-positivas dentro de suas células do timo (Figura 1), e 100% destes peixes irão desenvolver leucemia, as células-T se transforma 11. Enquanto uma pequena proporção de peixe-zebra pode ter uma leucemia mais avançado que é muito fácil de detectar no dia 28, a maioria terá apenas um GFP positivas timo (Figura 1), então as larvas devem ser examinados individualmente sob alta ampliação para garantir que todos positivos peixes são selecionados. GFP-T-positivo ALL células alcançarei&gt; 50% dos animais entre os dias 45-70. No exemplo fornecido, zebrafish foram sacrificados aos 65 dias de vida, e as células de leucemia foram isoladas e classificadas FACS para limitar transplante de diluição. Células isoladas que foram iodeto de propídio negativos e GFP-positivos (Figura 2) foram classificados em uma placa de 96 poços. Reanálise foi feita em 10.000 células ordenadas em ordem para avaliar a viabilidade (idealmente&gt; 95%) e pureza (o ideal é&gt; 92%, Figura 2). Transplantado T-alls geralmente surgem antes de 28 dias, mas alguns tumores podem levar mais de 60 dias para se desenvolver. Neste exemplo, no dia 28, os tumores fase inicial eram vistos como uma área de GFP células positivas perto do local da injeção (Figura 3B), enquanto alguns ONVITES T-eram mais progrediu, tendo expandido para preencher a cavidade peritoneal (Figura 3C) . Dados de ensaios de diluição limitante transplante de células a partir de três diferentes primário T-alls são mostrados na Figura 3D. Para esses experimentos, mais de 220 animais foram transplantadas, o que pode ser facilmente realizado por uma pessoa dentro de várias horas. Análise de dados usando o software ELDA mostrou que, em média, 1 em 135 T-ALL células foram auto-renovação leucemia propagação células (Figura 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 Zebrafish larvas injetadas na fase de uma célula com o pano:.:-CMyc + rag::-eGFP foram selecionados para o crescimento leucemia primária 28 dias após a injecção. Peixe (*) tinha GFP positivas as células T no timo, este peixe irá desenvolver T-ALL como as células-T se transformou ao longo do tempo. Esta fase é muito comum no dia 28. Um peixe (**) tinha um avançado T-ALL, que se espalhou para os tecidos moles. Os dois peixes restantes são negativas para o crescimento do tumor. A imagem foi obtida com ampliação de 16x. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Fluorescente marcado T-ALL células foram classificadas de animais doentes e utilizado no ensaio de limitar o transplante de células de diluição. Primeiro, um portão foi elaborado para selecionar células individuais (painel superior esquerdo), então as células iodeto de propídio negativos são selecionados (painel esquerdo do meio). Finalmente, um portão foi atraído para selecionar apenas GFP-positivas as células de leucemia para classificar (painel inferior à esquerda). Células devem ser novamente analisadas classificadas para avaliar a viabilidade e pureza antes do transplante (painéis à direita). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Zebrafish foram examinados para o crescimento leucemia 28 dias após o transplante. Os peixes são neg ou tumorative (A), tem um pequeno tumor em crescimento no local da injeção (B), ou ter uma leucemia progrediu (C). As imagens foram tiradas com ampliação de 7X. O número total de leucemia positivo peixe por número total de peixes transplantado, a cada diluição é gravado, como em (D). Os dados são introduzidos no programa ELDA web-based para calcular o número de auto-renovação de células de leucemia e os superiores e inferiores intervalos de 95% de confiança (E).

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Não há conflitos de interesse declarados.

A força principal de usar zebrafish na pesquisa do câncer é que um grande número de animais podem ser usados ​​a um custo relativamente baixo. Isto é especialmente importante em limitar testes de diluição transplante de células, onde as proporções de animais transplantados que desenvolvem tumores ao número total transplantados são usados ​​para determinar tumor de iniciação frequência celulares. No método aqui apresentado, mais de 70 animais receptores de transplante são usados ​​por ensaio, fornecendo uma estimativa exata do tumor propagação número de células. Tanto o número de animais utilizados e as doses de células tumorais transplantadas deve ser otimizado para um modelo de câncer de dado, por exemplo, se as experiências iniciais mostram tumor de iniciação células são raras, as doses podem ser úteis transplante de 100.000, 50.000, 10.000 e 1.000 células por transplante. Cepas singeneicos zebrafish são úteis para limitar a análise de diluição. No entanto, essas cepas ainda não são comumente usados ​​em todos os laboratórios, e alguns modelos de zebrafish câncer só existem em peixes alogênico. Transplantes de células limitar a diluição pode ser realizado em linhagens selvagens que foram submetidos a ablação imune, embora a freqüência de auto-renovação das células pode ser calculada como 1-10 vezes maior do que se singeneicos zebrafish foram utilizadas 8. É importante notar que as doses maior de células devem ser utilizados para transplantes em não imunes combinados, os destinatários irradiados, como algumas células do tumor não sobreviverá transplante em um microambiente estrangeiros. Além disso, muitos tumores começará a regredir após 21 dias quando o sistema imunológico do animal destinatário recupera, assim que os animais devem ser avaliados para o crescimento do tumor a cada 7 dias após o transplante. Os métodos aqui apresentados são adequados para uso com qualquer modelo de câncer de peixe-zebra, e até agora têm sido usados ​​para determinar tumor de iniciação freqüência de células em ambas as células T leucemia linfoblástica aguda 8, e um modelo de tumor sólido, rabdomiossarcoma 16. Estes tumores foram fluorescente etiquetado por co-injeção de embriões com dois oncogene e um marcador fluorescente, porque o DNA co-segrega, qualquer célula expressando o oncogene também expressar a proteína fluorescente 17. Enquanto fluorescência é recomendado, pois facilita o rastreamento do crescimento do tumor, sem a necessidade de sacrificar o animal e fornece uma maneira simples e direta para isolar células tumorais por FACS, é possível rotular as células tumorais com anticorpos específicos para tumor fabricantes para facilitar a sua purificação , embora a coloração de anticorpos em zebrafish pode exigir de otimização. Finalmente, uma vez que a incidência de tumor de células-propagação foi determinada para um tipo determinado tumor, é possível usar esses ensaios para identificar os mecanismos que governam a sua freqüência de células. Por exemplo, células primárias de tumor podem ser tratados com inibidores da via específica antes de limitar o transplante de diluição, ou peixe transplantado se podem ser tratados com drogas. Além disso, a genética dos tumores em si podem ser manipulados pela injeção de peixe palco de uma célula com um gene de interesse, de modo que os tumores resultantes primário sobre-expressam o gene. Nesses experimentos, qualquer efeito sobre a auto-renovação das células freqüência será observada nos ensaios de diluição limitante.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> NotI enzima de restrição </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Fenol: Clorofórmio </td><td> Bioquímicos EMD </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> KCl 5M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Escada de DNA de alta Faixa </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Singeneicos zebrafish </td><td></td><td> Referências 6-8 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Iodeto de propídio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 Micro &quot; </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40μm peneira de malha de células </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

Células auto-renovação de câncer são os tipos de células apenas dentro de um tumor que têm uma capacidade ilimitada para promover o crescimento do tumor, e são, portanto, conhecida como tumor de células-propagação, ou células de tumor inicial. Pensa-se que a segmentação dessas células auto-renovação de destruição irá bloquear a progressão do tumor e parar de recaídas, melhorando consideravelmente o prognóstico do paciente 1. A forma mais comum para determinar a freqüência de auto-renovação de células dentro de um tumor é uma limitação de diluição ensaio transplante de células, em que as células do tumor são transplantadas em animais receptores em doses crescentes, a proporção de animais que se desenvolvem tumores é utilizado o cálculo do número de auto-renovação de células da amostra de tumor original 2, 3. Idealmente, um grande número de animais seriam usados ​​em cada experimento diluição limitante para determinar com precisão a freqüência de tumor de células-propagação. No entanto, experimentos de larga escala envolvendo ratos são caros, ea maioria dos ensaios de diluição limitar o uso de apenas 10-15 camundongos por experimento. Zebrafish ganharam proeminência como um modelo de câncer, em grande parte devido à sua facilidade de manipulação genética e da economia em que experiências em grande escala pode ser realizada. Além disso, os tipos de câncer modelados em zebrafish foram encontrados para perto imitar o seu homólogo quatro doenças humanas. Embora seja possível transplantar células tumorais de um peixe para outro pela sub-letais de irradiação de animais destinatário, a regeneração do sistema imunológico após 21 dias muitas vezes provoca a regressão do tumor 5. A recente criação do peixe-zebra singeneicos facilitou enormemente estudos transplante tumor 6-8. Porque esses animais são geneticamente idênticas, transplantadas células tumorais enxertar robustamente em peixes destinatário e crescimento do tumor pode ser monitorado durante longos períodos de tempo. Singeneicos zebrafish são ideais para limitar os ensaios transplante de diluição em que as células tumorais não têm de se adaptar ao crescimento em um microambiente estrangeiros, o que pode subestimar a auto-renovação das células frequência 9, 10. Além disso, um transplante de células têm sido concluído com sucesso usando zebrafish singeneicos 8 e várias centenas de animais podem ser facilmente e economicamente transplantados de uma só vez, sendo que ambos servem para fornecer uma estimativa mais precisa de auto-renovação de frequência celulares. Aqui, um método é apresentado para a criação primária, fluorescente marcado com T-cell leucemia aguda linfoblástica (T-ALL) em zebrafish singênico, e transplantar esses tumores de limitar a diluição em peixes adultos para determinar auto-renovação de frequência celulares. Enquanto a leucemia é fornecido como um exemplo, este protocolo é adequado para determinar a freqüência de tumor de células-propagação usando qualquer modelo de câncer no zebrafish.

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Limitando diluição ensaios transplante de células são usadas para determinar a freqüência de tumor de células-propagação. Este protocolo descreve um método para gerar zebrafish singeneicos que desenvolvem leucemia fluorescente marcado e detalhes de como isolar e transplante dessas células de leucemia a limitar a diluição na cavidade peritoneal de peixe-zebra adulto.

Quantificar a freqüência de Tumor-propagação células usando Transplante de Células Limitando diluição em singênicos Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K visualizações.  Harvard Medical School. Limitando diluição ensaios transplante de células são usadas para determinar a freqüência de tumor de células-propagação. Este protocolo descreve um método para gerar zebrafish singeneicos que desenvolvem leucemia fluorescente marcado e detalhes de como isolar e transplante dessas células de leucemia a limitar a diluição na cavidade peritoneal de peixe-zebra adulto.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Traqueotomia: Um Método para Transplante de Células-Tronco para o pulmão

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...