O xenoenxerto derivado de pacientes com peixe-zebra é um poderoso modelo pré-clínico para predizer o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer in vivo. O protocolo descreve a geração do modelo a partir de uma peça cirúrgica do paciente. Ao xenoenxertar um pequeno fragmento de tecido em vez de isolar células em embriões de peixe-zebra, é possível manter o microambiente tumoral, que é o passo crucial para a progressão do tumor e a resposta à quimioterapia.
A grande vantagem do modelo é dada pelo seu potencial de prever o prognóstico do paciente em um período de tempo clinicamente relevante de apenas uma semana, atuando como uma ferramenta para a medicina personalizada. Iniciar o processamento da amostra lavando todo o tecido tumoral coletado do paciente com cinco mililitros de meio tumoral fresco. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta plástica Pasteur.
Aspirar e descartar cuidadosamente o meio de lavagem antes de repetir a lavagem três vezes. Imergir a amostra em um a dois mililitros de meio tumoral fresco. Corte a amostra do tumor em pedaços de cubo de um a dois milímetros usando uma lâmina de bisturi e, em seguida, coloque-os em um tubo plástico estéril de cinco mililitros com meio tumoral.
Depois de ajustar o McIlwain Tissue Chopper para 100 micrômetros de espessura, coloque as peças tumorais na mesa circular de plástico do picador e pique-as. Gire a mesa em 90 graus e repita o corte. Coletar os fragmentos de tumor picados em um tubo plástico de 15 mililitros contendo o meio tumoral.
Centrifugar os fragmentos tumorais picados a 300 G por três minutos antes de aspirar e descartar o sobrenadante. Incube os fragmentos com a solução de traço celular ou com um rastreador de células fluorescente alternativo, como CM-DiI ou Deep Red, por 30 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Durante a incubação, ressuspenda suavemente os fragmentos a cada 10 minutos.
No final da coloração, remova qualquer corante livre adicionando um meio tumoral suplementado com pelo menos 1% de proteína. O volume será cinco vezes o volume de coloração. Centrifugar os fragmentos a 300 G por três minutos e descartar o sobrenadante.
Adicione um mililitro de Fosfato Tamponada de Dulbecco ou DPBS e repita esta etapa de lavagem três vezes. Uma vez feito, suspenda os fragmentos em cinco mililitros de DPBS em uma placa de Petri de 60 milímetros. Para estabelecer os xenoenxertos derivados do paciente à base de peixe-zebra ou zPDX, anestesiar os embriões dois dias após a fertilização.
Em uma placa de Petri com três cilindros de agarose, coloque um embrião de peixe-zebra em um cilindro expondo um lado. Retire o excesso de solução para manter o embrião em uma película fina. Usando pinças estéreis, transfira o pedaço de fragmentos de tecido tumoral corados de uma placa de Petri de 60 milímetros para o suporte de agarose a 1% onde o embrião é colocado.
Em seguida, pegue o tecido e coloque-o na gema do embrião antes de empurrá-lo para o espaço perivitelino usando a microagulha de vidro puxada pelo calor. Adicione algumas gotas de E3 1% penicilina estreptomicina ao embrião para trazê-lo de volta ao líquido. Depois de repetir a implantação do tecido tumoral em todos os embriões, remova os suportes de agarose da placa de Petri e incube os embriões a 35 graus Celsius.
Duas horas após a implantação, verificar os embriões quanto aos xenoenxertos corretos com coloração positiva utilizando estereomicroscópio fluorescente. Descarte embriões mortos e os embriões sem fragmentos tumorais completamente dentro do espaço perivitelino. Uma vez feito, distribuir aleatoriamente os embriões em seis placas multipoços, igualmente divididas em grupos de acordo com o plano experimental.
Diluir os medicamentos misturando-os em E3 1%pen-strep para preparar o coquetel FOLFOXIRI. Após duas horas de implantação, retire o meio de cada poço e adicione o coquetel de drogas. Coloque os embriões na incubadora a 35 graus Celsius por três dias com trocas diárias do meio para renovar as drogas.
Para aquisição de imagens, capturar imagens sob uma objetiva de 40X do microscópio confocal. Use a resolução de 1024 por 512 pixels com um espaçamento Z de cinco micrômetros. As imagens de montagem de zPDXs adquiridas para analisar a apoptose detectada no ciano mostraram que a terapia combinada aumentou a apoptose celular em comparação com o grupo controle.
O estudo de caso relatou que um aumento estatisticamente significativo na fração de células apoptóticas em xenoenxertos implantados foi identificado para o grupo tratado com FOLFOXIRI em comparação com o grupo controle. O protocolo mostra um exemplo usando tecido de câncer de pâncreas, mas xenoenxertos derivados de pacientes de peixe-zebra podem ser estabelecidos a partir de diferentes tipos de câncer. Além disso, como o modelo tem baixo impacto ético, é facilmente explorável para triagem in vivo de novos medicamentos.
O método é tecnicamente desafiador e requer um operador especializado. A experiência prévia em manipulação de embriões de peixe-zebra e microinjeção acelerará o treinamento da técnica.
