O objetivo geral dessas técnicas é avaliar a fisiopatologia da retina no modelo de rato de retinopatia diabética induzida pela estreptozoocina. A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. A busca contínua está acontecendo para descobrir agentes farmacológicos com melhor eficácia e ação mais longa para tratar a retinopatia diabética.
O processo de descoberta de agentes farmacológicos em modelos animais pré-clínicos desempenha um papel vital. Esses modelos animais ajudam a entender as alterações estruturais e funcionais dos tecidos posteriores do segmento do olho. Por isso, vamos demonstrar três técnicas diferentes para estudar essas alterações nas questões posteriores do segmento.
Estamos demonstrando histologia para estudar alterações morfológicas de células da retina em camadas, ensaio de quebra de BRB para estudar BRB comprometido quantificando proteína vazada no vítreo do plasma, e também angiografia fluoresce para visualizar vasculatura retina usando corante FITC-dextran. Eutanize rato usando alta dose de pentobarbital e confirme sua morte sem batimentos cardíacos detectáveis. Enuclear o olho fazendo incisões usando uma lâmina de bisturi nas regiões nasais e temporais do olho.
Em seguida, corte ao longo de suas bordas para remover o olho da tomada orbital. Remova o excesso de gordura ao redor do olho e coloque-o em 5 mL de solução fixa. Incubar o olho em solução fixa por 24 a 48 horas.
Após a fixação, retire o olho da solução fixativa e transfira para a placa de Petri cheia de PBS de 10 mL. Usando micro fórceps, segure o olho com nervo óptico e faça um corte no pars plana com a ajuda de micro tesouras. Corte toda a margem da córnea para separar a xícara anterior e a xícara posterior do olho.
Remova a lente e corte o nervo óptico. Corte o copo posterior em duas metades, passando pelo nervo óptico. Transfira cada metade para as fitas separadas.
Desidratar o tecido aumentando gradualmente a concentração de etanol de 50% para 100% de etanol. E, finalmente, limpe o etanol com xileno. Impregnar o tecido com parafina pré-aquecida a 60 graus Celsius para substituir o xileno no tecido.
Prepare os blocos de parafina usando um molde de aço para manter o tecido e a fita como base. Durante a preparação do bloco, a parte do disco óptico do olho deve enfrentar a parte inferior do molde de aço. Encha a fita com parafina e transfira para uma superfície fria.
Monte a lâmina e o nos respectivos suportes em microtome. Usando um microtome, corte o excesso de cera de parafina e corte uma fita de cinco a seis seções com uma espessura de 5 micrômetros. Transfira a fita para a superfície do banho de água pré-aquecido para desdobrar a fita.
Colete as seções em um slide de vidro revestido com albumina. Deixe os slides secarem durante a noite a 37 graus Celsius. Para realizar a coloração de Hematoxilina e Eosin, pré-aqueça os slides a 60 graus Celsius por 1 hora para derreter a parafina.
Siga o procedimento de coloração conforme dado no manuscrito. Comece com a reidratação do tecido, e depois manche com Hematoxilina seguida de Eosin. Agora, desidrate o tecido e adicione meio de montagem nas seções.
Coloque o deslizamento da tampa nas seções e visualize sob microscópio leve. Para realizar o ensaio de quebra da barreira sanguínea-retina, anestesiar o rato usando cetamina e xilazina e confirmar o estado anestésico por beliscão do dedo do dedo do sol. Localize o coração e insira uma seringa de 1 mL com agulha de calibre 24 para extrair o sangue por punção cardíaca.
Uma vez coletado o sangue suficiente, transfira-o para o tubo revestido de EDTA. Misture-o suavemente para evitar hemólise. Enuclear o olho e transferi-lo imediatamente para gelo seco.
Em condições congeladas, inicie a dissecção do olho pela remoção da córnea e das lentes. Puxe o vítreo do segmento posterior do olho usando fórceps sem qualquer contaminação da retina. Transfira para tubo homogeneizador com três a quatro contas.
Homogeneize as amostras usando homogeneizador de contas em velocidade média por 10 segundos. Transfira amostras de sangue e humor vítreo em tubos de microcentrifuuge para processar ainda mais. Centrifugar ambas as amostras a 5,200 g por 10 minutos a 4 graus Celsius.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 250 microliters de reagente bradford em poços. Diluir amostras vítreas 10 vezes e amostras de plasma 20 vezes usando PBS. Adicione 5 microliters de amostras diluídas ao reagente bradford e misture bem.
Incubar as amostras por 20 a 30 minutos e, em seguida, medir a absorvência em 590 nanômetros usando um leitor de placas de 96 poços. A intensidade da amostra é diretamente proporcional à concentração de proteínas. Para realizar a angiografia da fluorescência, anestesia o rato usando 3% de isoflurane e confirme o estado anestésico por soco no dedo do dedo do sol.
Mergulhe a cauda em água morna antes de injetar o corante. Injete 1 mL de 50 mg por mL solução FITC-dextran na veia traseira lateral. Deixe o corante circular por 5 a 10 minutos.
Eutanize o rato usando pentobarbital e confirme sua morte sem batimentos cardíacos detectáveis. Enuclear o olho e proceder para a preparação da montagem plana. Para preparar o suporte plano de retina, coloque o olho em um Kimwipe livre de fibras e corte a porção anterior do olho.
Puxe lentamente a lente, junto com o humor vítreo, do segmento posterior do olho. Transfira o segmento posterior para a placa de Petri cheia de PBS e corte o nervo óptico. Agora, coloque a ponta do forcep pontiagudo entre esclera e retina.
Mova-o suavemente ao longo da borda do copo para ter certeza de que a retina não está presa à esclera em nenhum momento. Corte perto do disco óptico, de tal forma que a retina se desprende completamente da esclera. Uma vez confirmado que a retina não está presa à esclera em nenhum lado, empurre-a lentamente para dentro da solução PBS.
Com a ajuda de um forcep, transfira a retina para uma lâmina de vidro limpa sem causar nenhum dano a ele. Usando micro tesoura ou lâmina de bisturi, faça quatro cortes na retina, como mostrado, para dividi-la em quatro quadrantes. Remova o excesso de PBS do ambiente da retina e adicione meio de montagem anti-desbotamento no suporte plano da retina.
Cubra-o com uma mancha de cobertura e visualize o suporte plano sob microscópio confocal. É importante notar aqui que todo o processo de angiografia fluorescência é realizado sob luz mínima para evitar a saciecia da fluorescência do corante FITC-dextran. Em ratos diabéticos, as células da retina sofrem degeneração, o que leva a complicações adicionais.
Essas alterações estruturais podem ser visualizadas pela técnica de histologia para determinar o número celular e a espessura da retina. No caso de ratos diabéticos, a espessura das camadas de retina aumenta devido ao edema. Assim, essa técnica ajuda a testar vários potenciais agentes farmacológicos para tratar a retinopatia diabética.
Alterações metabólicas na retina devido ao diabetes causam perda de pericitos e quebra da barreira hemencefálica. Como há vazamento de proteínas e outras biomoléculas na retina e vítreos, os níveis de proteína total aumentam no vítreo de ratos diabéticos. Prevenir a quebra da barreira hemico-retina pode dificultar significativamente o progresso da retinopatia diabética.
Na retinopatia diabética, a expressão do fator de crescimento endotelial vascular aumenta que levam à formação de novos vasos. Esses vasos perturbam a estrutura normal da retina e, portanto, sua inervação é de preocupação primária para tratar a retinopatia diabética. A técnica de angiografia da fluorescência é utilizada para visualizar novos vasos sanguíneos e também vazamento de vasos sanguíneos, como destacado aqui.
No entanto, a angiogênese só é proeminente após seis a 12 meses de indução de diabetes. Esta técnica nos ajuda a quantificar o efeito do tratamento medicamentoso na inervação da angiogênese e do vazamento vascular. O tratamento futuro da retinopatia diabética precisa de agentes farmacológicos mais eficientes, mas os tratamentos futuros só podem ser alcançados através da melhor compreensão da patogênese da doença.
Dominar essas técnicas poderia ajudar os pesquisadores a ter uma melhor compreensão sobre a patogênese da retinopatia diabética, o que poderia levar a uma descoberta de melhores intervenções farmacológicas.
