Nós agradecemos o núcleo citometria de fluxo UMass: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu e Tammy Krupoch. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) e CA NIH T32-130807 (JRS). Recursos suportados pelo núcleo de Endocrinologia Diabetes Research Center conceder DK32520 também foram utilizados.

1. Colheita de tecidos <ol><li> Prepare tubos contendo 2-5 ml de tampão de coloração a frio (tampão fosfato (PBS), com adição de BSA 0,2% e glicose 5mM). Manter tubos em gelo antes da colheita de tecidos. </li><li> Camundongos abate de acordo com o protocolo aprovado apropriado (por exemplo, inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical). </li><li> Coleta de sangue por punção cardíaca em EDTA ou heparina de coleta de sangue, tubos para posterior análise, por exemplo, do hematócrito, contagem de reticulócitos ou análise CBC. </li><li> Colheita do baço e ossos, colocando tecidos de cada rato em um tubo separado, preparado na etapa 1. Fácil acesso ao baço é do lado esquerdo. Para a colheita de medula óssea, um ou ambos os fêmures. Mantenha tecidos colhidos no gelo. </li><li> Se desejar, pesar o baço. Ratos submetidos a uma resposta ao estresse eritropoiética é provável que mostram um aumento significativo no peso do baço. </li></ol> 2. Preparação de células do baço <ol><li> Usando um pré-umedecidos 3 ml êmbolo da seringa, empurre o baço, ou de parte do baço (idealmente, 0,1 gramas ou menos, o equivalente a cerca de 10 8 células) através de um filtro de células 40 mM estéril (Fisherbrand número de catálogo 22363547 ou outros) colocado no topo de um tubo de 50 ml. Manter o tubo em gelo durante este procedimento. Lave as células através do filtro com um total de 2 ml de buffer coloração. </li><li> Pipeta suavemente a suspensão de células tensas para quebrar qualquer pequenos aglomerados. Se necessário, re-tensão das células. </li><li> Lave as células duas vezes por centrifugação e re-suspensão em tampão frio. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Rendimentos típicos são 1-2 x 10 8 células / baço. Citometria de fluxo para análise, aliquote 1-2000000 células por amostra, tanto em tubos de coloração FACS (BD Falcon de poliestireno de fundo redondo de tubos, 352008) ou U bottom-placa de 96 poços (BD Falcon 353.910). Volume de coloração da amostra é de 200 mL, a uma concentração celular final 0,5-1 x 10 7 células / ml ou 1-2 x 10 6 células / mL de amostra 200. </li></ol> 3. Preparação de células da medula óssea <ol><li> Prepare 1 ou 3 ml seringas com agulha acoplada 26G, pré-cheia com tampão de coloração a frio. </li><li> Remover músculos ligados ao fêmur, de modo a visualizar o osso de forma clara. </li><li> Usando afiada tesoura cirúrgica, cortando ambas as extremidades do fêmur, o mais próximo possível às extremidades do osso. Isso deve revelar um pequeno furo em cada extremidade de corte, levando para dentro da cavidade da medula óssea, que atravessa o comprimento do fêmur. </li><li> Usando as seringas pré-carregadas no passo 1, inserir a agulha através de um desses buracos, e gentilmente liberar a medula para fora através do furo no outro extremo, em um tubo. </li><li> Dissociar as células liberadas por pipetagem gentil, e tensão através de um filtro 40 mM como para o baço acima (ver secção 2.1). </li><li> Lave as células duas vezes por centrifugação em tampão coloração a frio </li><li> Contar as células e ressuspenda como no ponto 2.4. Rendimentos típicos são cerca de 10 7 células por fêmur. </li></ol> 4. Preparação de células do fígado fetal <ol><li> Para preparar timed-fêmeas grávidas de ratinhos, ratos criados para o acasalamento, à noite; examinar para plugues vaginal antes das 10 horas do dia seguinte, o dia em que o plugue vaginal é detectado é considerado o dia 0,5. Pessoal veterinário pode ser capaz de ajudar os investigadores que não estão familiarizados com esta técnica para identificar as fêmeas grávidas. A gravidez também pode ser determinada pelo peso do mouse de monitoramento. </li><li> Cronometrado grávidas camundongos fêmeas são abatidas em dias 12,5-14,5 da gravidez. Os cornos uterinos foram removidos em um prato de Petri contendo gelada meio de cultura ou buffer de coloração. </li><li> Embriões são retirados de cada útero e no fígado fetal é dissecado. Um microscópio de dissecação é necessário para dia embrionário 12,5 (E12.5) ou menos. </li><li> Fígados podem ser dissociados mecanicamente por pipetagem no buffer, e são processados ​​individualmente em 96 placas de bem, ou agrupados, dependendo dos requisitos experimental. </li><li> Um fígado fetal em E13.5 tem ~ 10 7 células. As células são lavadas duas vezes em coloração de buffer e ressuspendido em 1-2 x 10 6 células / mL de amostra 200 para análise de citometria de fluxo. </li></ol> 5. Coloração de anticorpos por citometria de fluxo <ol><li> Preparar um anticorpo primário coloração pré-mistura para ser usado para todas as amostras, exceto para as amostras de controle, contendo o seguinte: <ul><li> ChromePure coelho IgG (Jackson, 015-000-003), para uma concentração final de 200μg/ml. Verificar a concentração de ações na garrafa (pode variar). Isto é usado para bloquear os receptores Fc das células mouse; espécies alternativas que podem ser usados ​​para isso são do rato ou o rato IgG IgG. Escolha das espécies é determinada pela presença potencial no protocolo de coloração de anticorpos dirigidos contra ratos secundário primário / mouse / rabbit anticorpos, caso em que essas espécies não pode ser usadod como anticorpos de bloqueio. Alternativamente, soro de coelho 5% também pode ser usado no lugar de IgG purificada. Uma outra alternativa é o uso de anticorpos monoclonais ou fragmentos Fab dirigido aos receptores Fc do mouse. O protocolo básico abaixo não incluem quaisquer anticorpos secundários e assim por IgG de qualquer das três espécies podem ser utilizadas. </li><li> CD71-FITC, diluído 1:200 (estoque 0,5 mg, BD-Biosciences, 553266) </li><li> Ter119-PE, diluído 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) </li><li> Quaisquer anticorpos adicionais dirigidos para epítopos da superfície de interesse, por exemplo, anticorpos dirigidos a Fas ou FasL (veja 1,2). Misturar a solução de anticorpo suavemente invertendo o tubo 2-3 vezes. </li></ul></li><li> Adicionar 200 mL da mistura pré-para cada amostra de células e gentilmente re-suspender as células. </li><li> Prepare amostras de células controle da seguinte maneira: <ul><li> &quot;Corado&quot;: essas células são deixados no buffer de coloração e fornecer a autofluorescência de fundo das células. </li><li> &#39;Cor Único &quot;controles: um tal controle é necessário para cada anticorpo / cor usados ​​no protocolo. As células nesses controles estão manchadas ou com um anticorpo conjugado diretamente primária, ou com ambos os anticorpos primário e um anticorpo conjugado secundário. Estes controles são usados ​​para corrigir a sobreposição espectral entre os canais. </li><li> &quot;Fluorescência menos um&quot; (FMO) controles: um tal controle é necessário para cada anticorpo / cor no protocolo: as células são coradas com todas as cores / anticorpos no protocolo, exceto para a cor / anticorpo para o qual este é o controle FMO. O controle FMO para um canal específico fornece a base verdadeira para aquele canal. Pode incluir não específica de anticorpos do isotipo mesmo, e conjugado com a mesma marca de fluorescência como o teste de anticorpo (controle isotipo). </li></ul></li><li> Incubar as amostras e controles relevantes no anticorpo primário mancha no gelo por 45 &#39;para uma hora no escuro (colocar cobertura de alumínio de alumínio em balde de gelo). </li><li> No final da incubação, lavar as células adicionando 3 ml de tampão de coloração para cada tubo de amostra e girar para 3 &#39;para 5&#39; em aproximadamente 400 xg, a 4 ° C. Se usar 96 placas bem, lave as células três vezes em um volume de 200 mL. </li><li> Caso, aplicar anticorpo secundário mancha. Aplicar e lavar como para o primeiro anticorpo mancha. </li><li> Se necessário, uma mancha com anexina V é aplicada no final da incubação, usando um tampão Hepes como nas instruções do fabricante. Esta mancha é aplicada por 15 minutos em temperatura ambiente, ou por 1 hora no gelo. </li><li> Células são re-suspenso por citometria de fluxo análise na coloração solução contendo um corante de DNA de células-impermeável, para excluir as células mortas. Corantes DNA estão disponíveis várias, incluindo iodeto de propídio, 7-amino-actinomicina D (7AAD), ou DAPI. A escolha entre estas depende dos canais disponíveis, dada a canais de retomada para a coloração de anticorpos específicos, e os canais disponíveis no citômetro de fluxo. 7AAD é obtido a partir BD-Biosciences (559.925) e usado de acordo com as instruções do fabricante. Para a coloração DAPI, faça um estoque de 1mg/ml em dimetilformamida (DMF) de pó (Roche, Cat # 236276), manter a -20 ° C, e diluir 1:10.000 a 1:15.000 na coloração buffer. </li></ol> 6. Citometria de fluxo de classificação <ol><li> Células são marcadas com anticorpos contra CD71, Ter119, marcadores de linhagem, e um corante de viabilidade, conforme descrito para o fluxo de citometria-análise (seção 5). Concentração celular durante a rotulagem pode ser aumentada para 5 x 10 7 / ml. </li><li> Misturar um volume igual de cada um dos seguintes anticorpos para fazer o mix mestre da linhagem: <ul><li> FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD PharMingen 553848 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD PharMingen 553087 </li><li> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD PharMingen 553061 </li><li> Rat FITC Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD PharMingen 557396 </li><li> Rat FITC anti-rato Ly 6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD PharMingen 553126 </li><li> Use a mistura mestre em 1:80 (Isto é equivalente a 1:400 diluição de cada anticorpo ações individuais, que são todos de 0,5 mg / ml). </li></ul></li><li> Use condições de baixa pressão de classificação e bicos de largura. Para a Aria (BD Biosciences) usamos 100 bico μ, 20 psi de pressão. </li><li> Coleta de buffer: PBS, com adição de 20% de soro fetal bovino. </li><li> Para verificar a pureza das populações classificadas, re-executar uma pequena alíquota de cada amostra em um buffer que contém um corante de viabilidade (7AAD ou similar). </li></ol> 7. Resultados representativos: CD71/Ter119 coloração de adulto da medula óssea ou baço identifica uma seqüência de desenvolvimento de quatro subconjuntos, ProE rotulados, Erya, EryB e Eryc (Figura 1) 1. Morfologicamente, estas correspondem a eritroblastos cada vez mais maduro. A figura 1 ilustra a seqüência de propagação na fase de análise de dados, que descarta evento muito pequeno (incluindo núcleos, glóbulos vermelhos), as células agregadas e células mortas. Expressão de proteínas da superfície celular podem ser medidos simultaneamente para cada um desses subconjuntos, somando os anticorpos relevantes, ao mesmo tempo como Ter119 CD71 e coloração. A Figura 1 mostra um exemplo de superfície celular expressão do receptor de morte Fas 1. Esta medida foi realizada em camundongos injetados com Epo, ou em ratos injetados com solução salina. É evidente que a epo suprime a expressão de Fas na população Erya in vivo 1. Expressão de proteínas intracelulares ou status do ciclo celular também podem ser medidos para as células em cada subconjunto. A figura 2 ilustra a análise do ciclo celular representante de células da medula óssea recém-colhido. Estas medidas requerem, além da coloração da superfície celular com CD71 e Ter119, a fixação e permeabilização das células para a rotulagem intracelular (ver secção Discussão). No fígado fetal, não-eritróide células são excluídos, pela passagem do &#39;Lin&#39; células que são negativos para CD41, Mac-1, Gr-1, B220 e CD3 (Figura 3). As células restantes são sub-divididos em 6 subgrupos, S0 a S5. As características precisas de células no fígado fetal é dependente da idade embrionária (ver secção Discussão). A análise do ciclo celular representante do subconjunto S3 em E13.5 fígado fetal é mostrada (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 O CD71/Ter119 subconjuntos eritróide no baço do rato A. estratégia Gating:.. Células do baço foram processados ​​e rotulados com anticorpos dirigidos a CD71, Ter119 e Fas. Esta figura mostra a estratégia de análise após a etapa de aquisição de dados. Histograma I mostra todos os eventos adquiridos. O portão diagonal representa eventos que são susceptíveis de ser uma única célula, excluindo doublets ou agregados maiores. Células nesta portão são ainda analisados ​​II histograma. Eventos aqui muito pequeno, provavelmente núcleos ou detritos, são excluídos. As células gated são mostrados na III histograma, onde DAPI-positivos células, que são susceptíveis de membrana-permeável células apoptóticas, são excluídos da análise posterior. IV histograma mostra a população resultante de células do baço viável. O portão ProE contém CD71 alta Ter119 células intermediárias. Ter119 células de alta são ainda analisados ​​em histograma V. Aqui células CD71 alta são subdivididas em menos maduros, grandes &#39;Erya&#39; eritroblastos (CD71 alta Ter119 alta FSC alto) e menores, mais madura &quot;EryB &#39;eritroblastos (CD71 alta Ter119 alta FSC baixa) . O subconjunto de eritroblastos mais maduros é Eryc (CD71 baixo Ter119 alta FSC baixo). VI histograma mostra da superfície da célula expressão de Fas, especificamente no subconjunto Erya, em camundongos, no estado basal (injetados com salina), e os camundongos injetados com uma única dose de EPO. Coloração com anticorpos Fas foi realizada simultaneamente com a coloração CD71/Ter119. Preparações de células B. Cytospin classificados de cada um dos subconjuntos indicado. As células foram coradas com Giemsa e com diaminobenzidina, este último gera uma mancha marrom com a hemoglobina. Dados Cytospin foi publicado originalmente em Liu et al. Blood. 2006 01 de julho; 108 (1) :123-33. Epub 2006 9 de março. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Análise do ciclo celular do CD71 alta Ter119 alta eritroblastos na medula óssea do rato. Camundongos foram injetados intraperitonealmente com BrdU, e do baço ou da medula óssea foram colhidas 30 a 60 minutos mais tarde. As células foram fixadas e permeabilizadas e além de ser manchada para CD71 e Ter119, foram coradas para incorporação BrdU em seu DNA a replicar com um anticorpo monoclonal dirigido a BrdU (protocolo permeabilização fixação e coloração BrdU foi de acordo com as instruções do fabricante). BrdU células positivas estão em fase S do ciclo. Células em interfase são BrdU-negativo e pode ser resolvido em fases G1 ou G2 / M, usando o DNA de corante 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 CD71/Ter119 subconjuntos eritróide no fígado do rato fetal A. estratégia Gating:.. Células do fígado fetal foram etiquetados para CD71, Ter119, e um coquetel de FITC-rotulados anticorpos dirigidos a marcadores de linhagem não-eritróide (&#39;Lin&#39;). Células viáveis ​​(7AAD-negativos) foram analisadas para expressão Lin, eo Lin-células são subdivididas em a S0 a S5 subconjuntos eritróide. Mais jovens, E13 fígado fetal é composto de eritroblastos menos maduros, mostrado pela ausência de células maduras na S4/S5 subconjuntos. Preparações de células B. Cytospin classificados de cada um dos subconjuntos indicado. As células foram coradas com Giemsa e com diaminobenzidina, este último gera uma mancha marrom com a hemoglobina. Dados Cytospin foi originalmente published em Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Análise do ciclo celular de subconjuntos fígado fetal eritróide. Fêmeas grávidas foram injetados com BrdU, e fígados fetais foram colhidas 30 a 60 minutos mais tarde, fixa, permeabilizadas e coradas com anticorpos contra CD71, Ter119 e BrdU. Estado do ciclo celular de células S3 é mostrado.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela University of Massachusetts Medical School IACUC comitê.

A metodologia de citometria de fluxo permite investigação simultânea de qualquer função celular que pode ser detectado com um anticorpo conjugado com fluorescência específica ou ligante, incluindo marcadores da superfície celular, a expressão da proteína, a sobrevivência celular, sinalização celular usando fosfo anticorpos específicos 3 e status de ciclo celular. Estas medições podem ser feitas em cada um de uma série de estágios de diferenciação subconjuntos específicos, no contexto da r...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Fas-biotina </td><td> BD PharMingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Estreptavidina-APC </td><td> Sondas moleculares </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 mM filtro célula estéril </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Poliestireno de fundo redondo de tubos para a coloração FACS </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U bottom-placa de 96 poços </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure coelho IgG </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (estoque 0,5 mg) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI em pó </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 </td><td> BD PharMingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD PharMingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD PharMingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> Rat FITC anti-rato Ly 6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD PharMingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD PharMingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Fluxo de kit </td><td> BD PharMingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Anexina V-biotina </td><td> BD PharMingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

O estudo da eritropoiese visa compreender como as células vermelhas são formadas a partir progenitores antes hematopoiéticas e eritróide. Especificamente, a taxa de formação de células vermelhas é regulada pelo hormônio eritropoietina (EPO), cuja síntese é desencadeada pela hipóxia tecidual. Uma ameaça aos resultados tecido adequado de oxigenação em um rápido aumento da EPO, conduzindo a um aumento na taxa de eritropoiética, um processo conhecido como a resposta ao estresse eritropoiética. O aumento resultante do número de eritrócitos melhora a entrega de oxigênio nos tecidos. Uma resposta ao estresse eficiente eritropoiética é, portanto, fundamental para a sobrevivência e recuperação de condições fisiológicas e patológicas, tais como altitude elevada, anemia, hemorragia, quimioterapia ou transplante de células-tronco. O rato é um modelo fundamental para o estudo da eritropoiese e sua resposta ao estresse. Eritropoiese rato definitiva (do tipo adulto) ocorre no fígado fetal entre os dias embrionárias 12,5 e 15,5, no baço neonatal e adulto no baço e medula óssea. Métodos clássicos de identificação de progenitores eritróides no tecido dependem da capacidade dessas células de dar origem a colônias de células vermelhas quando banhado em Epo contendo semi-sólido mídia. Sua progênie precursor eritróide são identificados com base em critérios morfológicos. Nenhum destes métodos clássicos permitir o acesso a um grande número de células em estágio de diferenciação eritróide específicos para o estudo molecular. Aqui apresentamos um método de fluxo de citometria de identificar e estudar a diferenciação progenitores estágio-específicas e de precursores eritróides, diretamente no contexto do tecido do rato recém-isoladas. O ensaio conta com os marcadores de superfície celular CD71, Ter119, e no parâmetro de fluxo de citometria de &quot;dispersão para a frente &#39;, que é uma função do tamanho da célula. O ensaio CD71/Ter119 pode ser usado para estudar progenitores eritróides durante a sua resposta ao estresse eritropoiética in vivo, por exemplo, em ratos ou camundongos anêmicos alojados em condições de baixo oxigênio. Também pode ser usado para estudar progenitores eritróides diretamente nos tecidos de ratos adultos geneticamente modificados ou embriões, a fim de avaliar o papel específico da via molecular modificado na eritropoiese.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biologia

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificação, Isolamento e Caracterização de Progenitores Fibro-Adipogênicos (FAPs) e Progenitores Miogênicos (MPs) em Músculo Esquelético no Rato

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas murinas

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

Autor em destaque: Avaliação do fluxo de mitofagia em células β pancreáticas usando abordagens complementares eficazes e robustas 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Análise quantitativa da autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa em autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...