Os autores agradecem o fluxo Citometria de Pesquisa Núcleo da Fundação do Cincinnati Children Research Hospital e Richard Demarco, Sherree amigo, e Scott Mordecai do Amnis Corporation (parte da EMD Milllipore) para suporte técnico especializado. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede K08HL088126 e R01HL116352 (TAK) e DK090971 P30 (YZ).

1. Longo prazo o cultivo in vitro eritropoiese (Ex vivo Erythroid Diferenciação Cultura Protocolo por Giarratana et al. 8, modificados e adaptados para rato Células) Este é um longo prazo de 3 etapas no protocolo eritropoiese vitro. Na primeira etapa (dias 0-4) 2 x 10 5 células / ml, são colocados em meio de crescimento de eritroblastos suplementado com factor de células estaminais (SCF), a interleucina-3 (IL-3), e a eritropoietina (Epo). Na segunda etapa (dias 5-6), as células são suspensas de novo a 2 x 10 5 células / ml e co-cultivadas com células aderentes do estroma (MS5) em meio de crescimento de eritroblastos fresco suplementado apenas com Epo. No terceiro passo (7-9 dias), as células são cultivadas sobre uma camada de MS-5 células em meio de crescimento de eritroblastos fresco sem citocinas até enucleação (Figura 1A). Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) deHospital Centro Médico Infantil de Cincinnati. <ol><li> Colheita de ossos e isolamento de células de medula óssea de baixa densidade <ol><li> Adicionar 2 ml de IMDM estéril contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) em um tubo cónico de 15 ml e guardar em gelo. </li><li> Eutanásia um 2-6 meses de idade do tipo selvagem C57/BL6 rato (junto com ou sem rato geneticamente alvo de interesse) seguindo o protocolo aprovado pela instituição (por exemplo, inalação de CO 2, seguido por deslocamento cervical). </li><li> Isolar ossos pélvicos, fêmures e tíbias de ambas as pernas com a pinça e bisturi, adicioná-los ao tubo contendo IMDM 2% FBS e manter em gelo. </li><li> Adicionar 1 ml de IMDM 2% de FBS num tubo de citometria de fluxo estéril e lavar ossos usando uma pinça e uma seringa de tuberculina com uma 25-L x 5/8 &quot;agulha. Lave IMDM 2% de FBS, através dos ossos, algumas vezes suavemente ( aspirando ~ 500 ul da suspensão de células e enxaguando-o de novo através do osso), e recolher as células da medula óssea para o fluxo cytometrtubo y. Flushing é completa quando os ossos aparecem em branco. </li><li> Filtrar célula-suspensão através de um conjunto de 40 mícrons coador de células na parte superior de um tubo cónico de 50 ml. Lavar filtro celular com IMDM 2% de FBS e utilizando o mesmo meio de ajustar o volume final da suspensão de células para 5 ml. </li><li> Prepare células da medula óssea de baixa densidade (ldbm) por centrifugação em gradiente de densidade: camada cuidadosamente os 5 ml de células-suspensão em 5 ml de separação celular gradiente de densidade média 1,083 g / ml em um tubo de 15 ml e rotação a 750 xg por 25 min à temperatura ambiente (RT) com nenhuma aceleração freio / baixo. </li><li> Transferência do sobrenadante (tudo até cerca da marca de 2 ml de o tubo de 15 ml, a fim de adquirir buffy coat) para um novo tubo de 15 ml e um desempenho mais uma lavagem com IMDM 2% de FBS a 525 xg durante 5 min a RT. </li><li> Sobrenadante aspirado e lisar quaisquer restantes glóbulos vermelhos (RBC) com a suspensão do sedimento em 3 ml de tampão de lise de RBC, durante 5 min à TA. Se uma maior pureza de eritroblastos érequerido na etapa final (por exemplo, para estudos bioquímicos), purificar células ldbm ainda neste passo para células neg Lin por separação magnética. </li></ol></li><li> Ex vivo eritróide protocolo de cultura de diferenciação a partir de células ou LDBM neg Lin (Figura 1A) <ol><li> Adicionar 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugação a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente e ressuspender as células peletizadas em 2 ml de meio de crescimento de eritroblastos (AGE), que consiste em: a. Médio StemPro-34, contendo b. 2,6% StemPro-34 suplemento médio, c. 20% de BIT-9500, d. Sulfato ferroso de 900 ng / ml, e. Nitrato férrico de 90 ng / ml, f. 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina g. 10 -6 M de hidrocortisona h. e citocinas recém-adicionado: i) 100 ng / ml SCF, ii) 5 ng / ml de IL-3, e iii) 3 UI / ml de Epo. </li><li> Contar as células usando um contador de células automatizado ou manual em um microscópio usando uma bainhaocytometer. </li><li> Placa numa placa de 6 poços de cultura de células a uma concentração de 5 x 10 5 células / poço para um volume final de 2,5 ml em EGM (2 x 10 5 ldbm células / ml) e incubar a 37 ° C (isto é considerado como o dia # 0 da cultura). </li><li> Mudança de meio por aspiração de 1,5 ml do sobrenadante, girando a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente, ressuspensão em 1,5 ml de meio fresco, contendo todos os três citocinas e voltar a adicionar aos poços cada dia em dias # 2, 3, 4, para optimizar fase proliferativa. No dia três, remover todas as células, e contagem dividido em número adequado de poços de forma a manter as concentrações de células assim de 2 x 10 ~ 5 células / ml. Manter a cultura a 37 ° C / 5% de CO 2 °. </li><li> No dia 4, as células placa MS5 (linha de células de estroma murino) para poços de uma nova cultura de células de 6 poços da placa. O meio de cultura de células é MS5 α-MEM contendo 20% FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. </li><li> No dia 5, contar o número decélulas (agora enriquecido significativamente em eritroblastos) em cada poço da placa de cultura original, usando um contador de células automático ou manualmente em um microscópio usando um hemocitómetro. </li><li> Levantar todas as células de cada poço e transferidos para tubos cónicos de 15 ml, girar a 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e dissolvem-se peletes com EGM fresco contendo apenas Epo (3 UI / ml) para uma concentração de 2 x 10 5 células / ml. </li><li> Aspirar o sobrenadante dos poços em que o MS-5 células foram plaqueadas no dia anterior (alvejado a 70-80% de confluência no momento da co-cultura) e adicionar as células eritróides nestes poços em EGM contendo apenas Epo (embora não o seu meio de escolha, MS-5 células sobreviver bem em EGM durante vários dias). </li><li> Mude médio acrescentando fresco EPO no dia # 6. </li><li> Mude médio no dia # 7, utilizando AGE sem citocinas adicionais. Nos dias 7 a 9, as amostras de teste para enucleação com citometria de fluxo após coloração com anti-Ter119 e Syto-16 diariamente e proceed a coloração de amostras para Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo (conforme detalhado na seção 3). Nota:. Antes do plaqueamento e no dia 2, 4, 6, e 7 de cultura, as células cultivadas para monitorizar o enriquecimento de eritroblastos e diferenciação com citometria de fluxo por meio da avaliação de marcadores de superfície CD44 e Ter119 vs tamanho (FSC) 9 Alternativamente CD71, Ter119, e FSC Também pode ser utilizado 10, 11. </li></ol></li></ol> 2. Rápida enucleação Ensaio, de acordo com o protocolo descrito por Yoshida et al. 12 com modificações (Figura 1B) <ol><li> Indução da eritropoiese Stress e estroma preparação de células para o cultivo in vitro eritropoiese <ol><li> Anestesiar a 2-6 meses de idade rato C57/BL6 tipo selvagem por diretrizes IACUC (por exemplo, com a solução de isoflurano). Certifique-se de que o rato foi anestesiado adequadamente, verificando a ausência de respostas reflexas a uma delicada pitada hind-pata e pararespirações regulares durante o procedimento. Use veterinário pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Induzir o estresse eritropoiese via cauda sangrando até a um volume final de 500 mL. Usando uma seringa de insulina, injetam igual volume de soro fisiológico por via intraperitoneal para garantir reposição volêmica do animal (segure animal em posição de Trendelenburg antes de injetar e injetar no abdome inferior, de modo a não danificar os órgãos internos). </li><li> Não deixe o mouse autônoma até que ele recuperou o controle motor, como indicado pelo animal começando a se mover ao redor da gaiola e ser capaz de ficar em pé e andar sem cair. O mouse Phlebotomized é colocado em uma gaiola sem outros ratos. </li><li> Após 2 dias, a placa de MS-5 células em cavidades de uma placa de 24 poços de cultura de células. Incubar MS-5 células a 37 ° C / 5% de CO 2 em meio de células MS5 (a-MEM contendo 20% FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina) com o objectivo de ser 70-80 % confluentes ipoços n placa após 48 horas. </li></ol></li><li> Colheita de baço e processamento de esplenócitos <ol><li> Quatro dias (96 horas) após a indução do estresse eritropoiese, eutanásia anteriormente sangrou mouse através de protocolo IACUC-aprovado (por exemplo, inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical). </li><li> Baço Colheita e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml contendo IMDM 2% FBS e manter em gelo. </li><li> De volta ao laboratório, em cultura de tecidos sob as condições de cobertura estéreis, inverter tubo contendo baço sobre um filtro de células de 40 mícrons situado no topo de um tubo de 50 ml. Esmagar baço usando o êmbolo de uma seringa de plástico de 5 ml. </li><li> Lavar filtro celular com IMDM 2% de FBS e utilizando o mesmo meio, ajustar o volume final da suspensão de células para 5 ml. </li><li> Camada cuidadosamente a suspensão de esplenócitos em 5 ml de 5 ml de separação de células por gradiente de densidade média 1,083 g / ml num tubo de 15 mL e centrifugação a 750 xg durante 25 min à temperatura ambiente com ausência de aceleração freio / baixo. </li><li> Transferênciasobrenadante (solução para baixo para sobre a marca de 2 ml de o tubo de 15 ml, a fim de adquirir buffy coat) para um novo tubo de 15 ml e um desempenho mais uma lavagem com IMDM 2% de FBS a 525 xg durante 5 min à TA . </li><li> Sobrenadante aspirado e as células vermelhas do sangue lisar por suspensão do sedimento em 3 ml de tampão de lise de RBC, durante 5 min à TA. </li><li> Adicionar 7 ml de IMDM 2% FBS para lavar as células e para diluir e neutralizar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos e centrifugação a 525 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e suspender as células precipitadas em 2 ml de meio de crescimento de eritroblastos (AGE). </li></ol></li><li> Cultura dos esplenócitos isolados de baixa densidade, enriquecidos em eritroblastos, em plástico (primeira fase de rápido cultura in vitro eritropoiese) <ol><li> Contagem de células em um contador de células automatizado ou manualmente por um hemocitômetro. Número habitual de células isoladas por baço nesta fase é de aproximadamente 15 x 10 6. </li><li> Suspender as células ainda em EGM contendo as citocinas (em fconcentrações inal): SCF 50 ng / ml, IL-3, 5 ng / ml, e Epo 2 U / ml. </li><li> Placa de 1-5 x 10 6 células, num volume final de 1 ml / poço (o mesmo número de células por poço, dependendo do número total de células) de uma placa de cultura celular de 24 poços e incubam O / N a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Cultura de eritroblastos em células MS5 (segunda fase de rápido cultura in vitro eritropoiese <ol><li> Aspirar o sobrenadante do poço de plástico e levantar as células (altamente enriquecidos em eritroblastos) por adição de 2 ml de frio EDTA 10 mM em PBS durante 5 min, em gelo a cada poço. </li><li> Colocar as células em tubos frescos, lavar uma vez em EGM (sem citocinas) e ressuspender na mesma. </li><li> Placa de 5 x 10 5 x 10 -1 6 células num volume de 1-2 ml a cada MS5 poço de uma placa de 24 poços revestidas com células. Se os inibidores farmacológicos estão sendo utilizados na experiência, adicioná-las em concentrações adequadas agora. </li><li> Incubar durante 6 a 8 horas (tempo guiado pelaobservação microscópica de aproximadamente 30% -40% de enucleação na amostra não tratada WT). A ligação de eritroblastos para MS-5 células acelera sua enucleação. </li><li> Elevador células de cada poço pela adição de 2 ml de PBS frio + EDTA 10 mM, durante 5 minutos, em gelo. Junto com os eritroblastos, MS-5 células também serão coletados, mas isso mais tarde pode ser facilmente excluídos durante a análise por citometria de fluxo como FSC oi Ter119 - células. </li><li> Nesta fase, as células podem ser fixadas e coradas para a análise por multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo. </li></ol></li></ol> 3. Coloração de Erythroblasts para localização de proteínas intracelulares ou lipídicas Balsas Durante enucleação por Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo <ol><li> Lavar as células com PBS, girar 525 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. </li><li> Fixar as células por ressuspensão sedimentos celulares em 500 ul de 3,7% de formaldeído em PBS, durante 15 minutos (tempo de fixação pode variar, dependendo do antigen sendo sondado) e pipetar suavemente. </li><li> Transferir 1,5 ml de tubos de centrífuga de plástico e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Rotação sobre um banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, aspirar o sobrenadante e realizar uma lavagem através da adição de 500 ul de PBS a cada tubo e pipetando suavemente. </li><li> Gire em um banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 segundos, o sobrenadante aspirado e manter os tubos no gelo por pelo menos 15 min. Permeablization passos 3,6-3,9 deve ser feito de forma rápida e eficiente, e seguindo fiação / aspiração à temperatura ambiente, pelotas de células deve ser imediatamente colocada de volta no gelo, a fim de que as células para melhor conservar a sua integridade. </li><li> Tomar as soluções de acetona para fora do freezer -20 ° C e colocar no gelo. Permeabilizar as células por ressuspensão sedimentos celulares em primeiro lugar 500 mL de gelo frio de 50% de acetona (1:1 com dH 2 O) e de pipetagem suave. </li><li> Giro no banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 segundos, o sobrenadante aspirado e células ressuspender pelotas em 500 mL60; gelada 100% de acetona com cuidado pipetando. </li><li> Giro no banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 segundos, o sobrenadante aspirado e células ressuspender pelotas mais uma vez em 500 mL gelada 50% de acetona com cuidado pipetando. </li><li> Rotação no banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, aspirar o sobrenadante e lava-se as células uma vez em tampão frio de FACS (PBS + 0,5% BSA), pipetando suavemente. </li><li> Prepare rotulagem cocktail com anticorpos ou marcadores para as moléculas de interesse: 0,1 mL U/100 AF488-phalloidin para coloração F-actina e 1 μl/100 mL Ter119-PECy7 para coloração de células eritróides. Coloração alternativa ou adicional, também pode ser feita utilizando AF-488-anti-β-tubulina de anticorpos (1:50), o AF-594 conjugado com a toxina da cólera subunidade B para rotular jangadas lipídicas (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticorpo primário para a cadeia leve da miosina reguladora fosforilada (1:50), seguido de anti-coelho de AF-488 conjugado com anticorpo secundário (1:400), e anti-γ-tubulin anticorpo primário de coelho (1:100), seguido por anticorpo anti-coelho secundário de AF-555-conjugado (1:300). </li><li> Após a aspiração do sobrenadante, os sedimentos celulares ressuspender em 100 ul de o marcador de cocktail, pipeta gentilmente e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampão de SCAF que continha 2,5 pM de DRAQ5 corante nuclear. </li><li> Lave as células em tampão FACS, girar no banco microcentrifuge 2.000 xg por 20 s, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 60 mL de tampão FACS contendo DRAQ5. </li><li> As amostras são executados sobre o citómetro de fluxo de imagem para recolher, pelo menos, 10.000 acontecimentos por experiência, compensar os ficheiros de dados brutos, tal como publicado anteriormente 13, e analisar os resultados, como mostrado na Figura 2, utilizando o software de análise de imagem específico para a citometria de fluxo. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Nos últimos anos, no estudo de enucleação eritroblastos ganhou força crescente, uma vez que é o passo em culturas in vitro da eritropoiese que é mais difícil de reproduzir de forma eficiente, a fim de alcançar, a produção em larga escala bem sucedida de células vermelhas do sangue ex vivo. Até recentemente, o estudo de enucleação eritroblasto utilizada microscopia de fluorescência, principalmente, e citometria de fluxo métodos. Métodos de microscopia de fluorescência, embora útil na ...

Diferenciação terminal na linhagem eritróide em mamíferos conclui com o processo dramático da enucleação, através do qual o eritroblastos ortocromático expele o seu núcleo envolto por uma membrana (pyrenocyte) 1, gerando um reticulócito 2. O mecanismo exacto deste processo, o qual também é o passo limitante da taxa de sucesso de, em larga escala, a produção de células vermelhas do sangue in vitro, ainda não está completamente elucidado. A localização de proteínas-chave e estruturas dentro eritroblastos enucleação depende da utilização de lâmpadas fluorescentes e microscopia eletrônica 3-5. Este processo tedioso resulta tipicamente na identificação de um número limitado de eventos de enucleação e nem sempre permitem uma análise estatística significativa. Expandindo um método de identificação eritroblasto descrito anteriormente por McGrath et al. 6, desenvolvemos uma nova abordagem de identificar e estudar os eventos de enucleação por Multi-espectral Imalagem Citometria de Fluxo (multiparamï imagens de células de alta velocidade do fluxo, um método que combina a microscopia de fluorescência, citometria de fluxo) 7, que pode proporcionar um número suficiente de observações para obter medições e análise estatística. Aqui, nós descrevemos dois primeiros métodos in vitro da eritropoiese cultura utilizadas, a fim de sincronizar os eritroblastos e aumentar a probabilidade de captura de enucleação, no momento da avaliação. Em seguida, descrevem em detalhe a coloração de eritroblastos após fixação e permeabilização, a fim de estudar a localização de proteínas intracelulares ou jangadas lipídicas durante enucleação por citometria de fluxo de imagem multi-espectral. As amostras são executados em um fluxo de imagens citômetro e as células coletadas são fechadas de forma adequada para identificar eritroblastos ortocromáticos 6. Eritroblastos ortocromático são então analisados ​​com base em sua relação de aspecto, como medido em campo claro imalagem, contra o seu valor para o parâmetro do delta centróide XY Ter119-ADN, a qual é definida como a distância entre os centros das áreas manchadas para Ter119 e de ADN, respectivamente. A população de células com baixa relação de aspecto alta e centróide delta XY Ter119/DNA é altamente enriquecida em enuclear células. Usando o tipo selvagem (WT) eritroblastos contra eritroblastos com deleção Mx-Cre mediada condicional de Rac1 em Rac2 - / - ou Rac2 combinado - / -; RAC3 - / - base genética e este protocolo nova análise de fluxo de imagem multi-espectral citometria, demonstramos recentemente que se assemelha a enucleação citocinese assimétrico e que a formação de um anel de actomiosina regulada em parte por Rac GTPases é importante para a progressão da enucleação 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Eritropoiese em mamíferos conclui com o processo dramático da enucleação, que resulta na formação de reticulócitos. O mecanismo de enucleação ainda não foi totalmente elucidado. Um problema comum encontrado quando se estuda a localização de proteínas-chave e estruturas dentro eritroblastos enucleação por microscopia é a dificuldade de observar um número suficiente de células em enucleação. Desenvolvemos um novo protocolo de análise de imagem usando multiparamétrica de alta velocidade em células de fluxo (multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo), um método que combina a microscopia de imunofluorescência com citometria de fluxo, de modo a identificar de forma eficiente um número significativo de eventos de enucleação, que permite obter medidas e realizar análises estatísticas. Primeiro, descrever aqui dois in vitro da eritropoiese métodos de cultura utilizados para sincronizar eritroblastos murino e aumentar a probabilidade de captura de enucleação no the tempo de avaliação. Em seguida, descrevem em detalhe a coloração de eritroblastos após fixação e permeabilização, a fim de estudar a localização de proteínas intracelulares ou jangadas lipídicas durante enucleação por citometria de fluxo de imagem multi-espectral. Juntamente com o tamanho e coloração DNA/Ter119 que são usados ​​para identificar os eritroblastos ortocromaticos, que utilizam os parâmetros &quot;relação de aspecto&quot; de uma célula no canal de campo brilhante que ajuda no reconhecimento de células alongadas e &quot;delta centróide XY Ter119/Draq5 &quot;que permite a identificação de eventos celulares em que o centro de coloração Ter119 (reticulócitos nascente) é muito distante do centro de coloração DRAQ5 (núcleo passando por extrusão), indicando, assim, uma célula prestes a enuclear. O subconjunto da população eritroblasto ortocromático com alta centroid delta e baixa relação de aspecto é altamente enriquecido em enuclear células.

Em primeiro lugar, as células são analisadas quanto a sua Brightfield Aspect Ratio (a razão entre o comprimento da sua menor contra o seu eixo maior) e os seus arredores Brightfield (indicativo do seu tamanho). Eventos com um valor Brightfield Área inferiores a 20 e superiores a 200 são na maior parte dos restos celulares e agregados, respectivamente, e são excluídos da análise (Figura 2A). Células individuais (gate &quot;R1&quot;) são analisados ​​de acordo com o seu valor para o parâmet...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K visualizações.  University of Cincinnati College of Medicine.  O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos. 

Vídeo: Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biologia

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplicação por citometria de fluxo de protoplastas de tubérculos isolados de medição

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.