Agradecemos a Dibbits Bert para assistência técnica. O Grupo de Melhoramento Animal e Genomics, Universidade de Wageningen, Holanda, generosamente acolhido nos seus laboratórios. O pessoal do Pássaro Ottenby Observatory, na Suécia, é agradeceu captura e amostragem do marreco, em especial Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Agradecemos a Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres para filmar em Ottenby, e Mano Camon para filmar no laboratório. Daniel Bengtson desde fotografias de pato bonito para a parte de vídeo dessa publicação. Material livre mais longe da Biblioteca de Imagens CDC de Saúde Pública (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) foi usada: A micrografia eletrônica (n º 280; pelo Dr. Erskine Palmer) e ilustração (n º 11.823; por Douglas Jordan) do vírus influenza. O apoio financeiro foi dado pelo KNJV (Royal Holanda Hunters Association), o Ministério Holandês da Agricultura, o Faunafonds ea Stichting Trusts de Eik (ambos na Holanda), o sueco Research Council (não concedem. 2007-20774) e da CE -fundada Newflubird projeto. Produtos químicos de isolamento de RNA foram um presente generoso de Ambion, Inc, a empresa RNA. Esta é a contribuição n ° 245 do Pássaro Ottenby Observatory.

1. Trapping pato e cloaca Swab <ol><li> Armadilha dabbling patos do gênero Anas (ou outras aves) em uma gaiola, atraindo-os com patos lure ou comida, e colocá-los em caixas de bordo individuais cartão. Tempo de transporte na caixa devem ser mantidas a um mínimo, por exemplo, através da instalação de uma estação de campo a uma curta distância para a armadilha. Circunstâncias logística pode variar em cada estudo. O conselho e aprovação do respectivo comitê de ética animais precisa ser buscado para cada novo set-up. Alternativamente, também caçador de aves tiro pode ser amostrados. </li><li> Retire o pato da caixa, segurando suas asas apertadas ao corpo. Uma amostra caindo frescos, que estará presente na maioria dos casos, directamente a partir do fundo da caixa. Pegá-los com uma zaragatoa estéril e aplicar o líquido para um cartão de FTA Whatman. Se não, execute swabbing cloacal. </li><li> Vire o pato em suas costas. Isto permite o acesso à cloaca e facilita a amostragem. A cloaca é uma estrutura protuberante situado abaixo do abdômen, perto da base da cauda. Uma pessoa experiente poderia prender e amostra da ave, ao mesmo tempo, ou então uma segunda pessoa pode ajudar. </li><li> Insira cuidadosamente o plástico estéril rayon swab (Copan, Itália) cerca de 1 cm e fazer um redemoinho suave da cloaca. Rolar o swab com os fluidos da cloaca sobre a superfície de um cartão de FTA Whatman. Após a amostragem foi realizada libertação imediata dos animais é desejável. </li><li> Seca os cartões FTA em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora, em seguida, armazenar cada amostra individualmente em sacos de papel (envelopes, por exemplo). Armazenamento é possível à temperatura ambiente, possivelmente com contas de sílica em climas úmidos. O envio e recebimento de funcionários das instituições de biossegurança pode permitir a enviar cartões FTA por correio normal, uma vez que os patógenos se tornam inativos em contato com a superfície do cartão FTA. </li></ol> 2. Isolamento de RNA viral <ol><li> Extrair o material de cartão de FTA, incluindo fezes / fluido cloacal. Perfura três discos com um perfurador milímetros Harris 2 e colocar todos os em um poço de uma placa de RNase 96well livre. Entre cada nova amostra, limpe o perfurador cuidadosamente com álcool e uma precisão Kim wipe (Kimtech). Sempre usar controles positivos e negativos. Um controle positivo pode consistir de uma cepa de laboratório recém-aplicado a um cartão de FTA, ou uma amostra natural, que é saber para produzir um resultado positivo. Como controle negativo, punch out discos de um cartão FTA vazio. Além disso, deixar o outro bem livre para um controle de PCR mais tarde, em sua experiência (com a água como modelo). </li><li> Adicionar 70μl RNA solução de extracção rápida (Ambion) e sele-a placa (AbGene Thermo-Sealer). Incubar 5 minutos em um agitador placa à temperatura ambiente com a velocidade determinada que não cause spill-over (isso depende do modelo utilizado placa shaker, teste de antecedência). </li><li> Realizar o isolamento viral RNA de acordo com protocolos do fabricante com o MagMAX-96 isolamento viral RNA kit (Ambion). Em resumo: Adicionar 130μl preparado lise / solução de ligação (do kit) a cada poço. Transferência de 50μl FTA extraído de material de cartão a cada poço. Agite placa por 1 minuto. </li><li> Adicione a mistura preparada 20μl talão (do kit) para cada amostra e misture pipetando para cima e para baixo. Agitar na velocidade determinada por 5 minutos. Moléculas de RNA que se ligam à esferas magnéticas. </li><li> Mova a placa para um campo magnético de 96 poços ficar para capturar as contas. Dependendo do modelo de suporte magnético utilizado, isto pode demorar mais de 5 minutos. Quando a solução se tornou completamente claro, remover e descartar o sobrenadante. Em seguida, retire a placa do suporte magnético. </li><li> Lave as contas duas vezes com solução de lavagem 1 e duas vezes com solução de lavagem 2 (do kit). Para cada uma das quatro etapas de lavagem adicionar solução de lavagem 150μl preparados para cada amostra, agitar durante 1 minuto na velocidade determinada, mova a placa para o suporte magnético, a captura de contas por cerca de 5 minutos (ou até que a solução é completamente claro), remover e desprezar o sobrenadante. Em seguida, retire a placa do suporte magnético, adicione a solução de lavagem seguinte, e realizar as etapas de lavagem, como anteriormente. Após a etapa de última lavagem, remover solução de lavagem, tanto quanto possível e ar seco as contas à temperatura ambiente em agitador placa por 2 minutos. </li><li> Adicionar 50μl de tampão de eluição (do kit) para liberar a partir do RNA contas e agitar durante quatro minutos no agitador de placa. Captura de contas, como descrito anteriormente. O sobrenadante agora contém o RNA isolado que está pronto para aplicações a jusante. </li></ol> 3. RT-PCR da Matriz AIV Gene Realização de transcrição reversa PCR (RT-PCR) com o One-Step RT-PCR de acesso do sistema (Promega) em 25 mL reações (ajustado de Kraus et al 18 e et al Fouchier 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 tampão </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> cartilha M52C 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> cartilha M253R 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV transcriptase reversa (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Polimerase Tfl (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Amostra de RNA </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Condições de PCR em um termociclador T1 Biometra são: transcrição reversa inicial de 45 minutos a 45 ° C, seguido por 2 minutos de desnaturação inicial a 94 ° C e 40 ciclos de: 94 ° C por 1 minuto, 56 ° C por 1 minuto, e 68 ° C por 2 minutos. Um alongamento 7 minutos adicionais a 68 ° C conclui a amplificação. 4. Triagem para AI-amostras positivas e Purificação de Fragmentos orientado por Gel <ol><li> Carga 2μl do produto da PCR misturado com corante de carregamento 2μl 5x (BioRad) e água 6μl em um gel de agarose 1% (Roche) corado com brometo de etídio 1% (2.5μl por 100 ml de gel) para um pré-requisito. </li><li> Executar o gel durante 1 hora a 120V, juntamente com um tamanho padrão de DNA (BioRad carga EZ 100 bp ladder), visualizar com um sistema de documentação de gel. Veja um exemplo na Figura 1. </li><li> Selecionar amostras com fragmentos amplificados na faixa de tamanho esperado (entre 200 pb e 300 pb (fragmento alvo é 244 bp). Carregue o volume de reação toda PCR (dos quais ~ 23μl são à esquerda) desses candidatos com corante de carregamento 6μl 5x em um 2 brometo de etídio% corado agarose gel e correr por 2 horas. </li><li> Coloque o gel em um transiluminador UV (bioblock Científico) e inspeccionados visualmente. Veja um exemplo na Figura 2. Bandas de consumo do tamanho correto gel com um bisturi e colocados em tubos individuais 1,5 ml de reação. Purificar fragmentos de gel, por exemplo com a Zymoclean DNA Gel Recovery Kit (Zymo Research). </li></ol> 5. Seqüenciamento e Identificação de Produtos PCR <ol><li> Realização de seqüenciamento Sanger dos fragmentos alvo, por exemplo, em um seqüenciador ABI 3730 capilar com ABI Big Dye 3,1 Química (Applied Biosystems). Prepare reações de sequenciamento em volumes contendo 10μl 10-20 ng gel-purificada modelo de cDNA, tampão de diluição 1.75μl 5x, 0.5μl Big Dye premix V3.1, uma cartilha mL para a frente (M52C 20, 10 mM), e ddH2O. Condições de ciclismo são: 1 min de desnaturação inicial, seguido por 25 ciclos de: 10 s em 96 ° C, 5 s em 45 ° C e 4 min a 60 ° C. Purificar e preparar a reação de seqüenciamento de acordo com os protocolos internos. </li><li> Identificar seqüências de cDNA, resultando em bancos de dados de nucleotídeos, como GenBank23, por exemplo, ferramentas baseadas na web, tais como BLAST no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Resultados representativos: Marreco (Anas platyrhynchos) foram amostradas na Ottenby Bird Observatory em dezembro de 2007. De cada um pato selvagem em uma amostra de cartão FTA foi tomada, conforme descrito neste protocolo. Após a distribuição, os cartões FTA foram mantidos em freezer a -20 ° C por dois anos. A amostra mesmo cartão FTA do laboratório isolado testado em Kraus et al. 18 foi incluído como controle positivo, bem como nove diluições de série de dez vezes isso. Dois controles negativos foram i) a extração de um cartão FTA vazio, para testar se houve carry-over da perfuração, e ii) reação RT-PCR em que água livre de nuclease foi usado como modelo, para testar se a contaminação ocorreu durante ou na preparação da reação de PCR. 84 amostras foram analisadas. Uma imagem gel dos produtos de PCR a partir desses 84 amostras podem ser encontrados na Figura 1. A partir de amostras naturais uma infinidade de bandas inespecíficas pode ser observada devido à presença de contaminações microbianas diversas nas fezes. No entanto, o fragmento alvo do par de primer é 244 bp de comprimento. O volume de reacção da PCR inteiro de um subconjunto das amostras que produziram fragmentos em cerca de faixa de tamanho correto (entre 200 pb e 300 pb) foi carregado no gel (Figura 1). Uma ilustração do que das bandas foram cortadas do gel pode ser encontrado na Figura suplementares 1. Além do controle positivo, duas dessas amostras (69.899 e 69.912) foram positivas pelo novo protocolo. A pesquisa BLAST no banco de dados NCBI nucleotide revelou sua identidade como AI matriz gene (Figura 3), enquanto todas as outras bandas se assemelhava seqüências bacterianas mais de perto, ou não deu uma seqüência legível a todos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Figura 1. Gel imagem de uma triagem preliminar dos produtos de PCR. 2 mL do produto PCR de controle positivo, sdiluições erial do controlo positivo, dois controles negativos e 84 amostras de cloaca foram carregados. 48 amostras são mostrados no painel de gel superior, e 48 amostras no painel inferior. Setas vermelhas indicam pistas gel utilizado para 100 bp DNA de tamanho padrão. Para ilustração, círculos vermelhos mostram bandas na faixa de tamanho esperado. Círculos azuis indicam um amplicon inespecíficos (canto superior esquerdo) ou um artefato de primer dimer abaixo de 100 pb no tamanho (inferior direito). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Figura 2. Amostras de seleção de amostras com fragmentos na faixa de tamanho correto. Com bandas entre 200 pb e 300 pb (244 pb do fragmento alvo) foram escolhidos. A seta verde indica que o controle positivo, as duas setas vermelhas indicam as amostras que foram confirmados para ser AIV positiva, comparando suas seqüências de cDNA ao banco de dados NCBI nucleotídeos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Figura 3. Captura de tela de uma pesquisa BLAST representante no NCBI. Uma das sequências de cDNA obtidas a partir dos fragmentos excisados ​​foi consultado no banco de dados de nucleotídeos no site do NCBI. A amostra é correctamente identificadas como AI fragmento do gene Matrix. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Para ver a versão completa tamanho da imagem, clique aqui.</a> <img alt="Figura complementar 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Figura S1 suplementar. Bandas de amostras selecionadas excisadas de gel. Esta foto foi tirada a partir do gel apresentado na Figura 1 após bandas candidato entre 200 bp e 300 bp foram cortadas.

<ol>
	<li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+evolution+of+avian+migration.">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li><li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza:+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists.">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li><li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+virulence+of+the+1918+"Spanish"+influenza+virus.">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li><li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+flu+goes+global.">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li><li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1.">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns.">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe.">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China.">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li><li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+viruses+in+water+birds.">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange.">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li><li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+bird+influenza+survey,+Canada,+2005.">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li><li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe.">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li><li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests.">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li><li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks.">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li><li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge,+Alaska,+during+August+2005.">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li><li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces.">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li><li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sample+type,+temperature+and+RNAlater+(TM)+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA.">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li><li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+surveillance:+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues.">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li><li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper.">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li><li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+(FTA).">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li><li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+typing:+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure.">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li><li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene.">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

Trapping, manuseio e amostragem de aves foram feitos seguindo a legislação nacional e foram aprovados pelo Conselho Sueco de Agricultura e da pesquisa com animais comitê de ética.

O protocolo aqui descrito fornece um método complementar para a tela amostras fecais ou similar para a presença de AIV. Foi especialmente projetado para fazer coleta de amostras rápida e fácil. Isto torna possível para as pessoas menos treinados, como caçadores ou gerentes dos animais selvagens, para contribuir para a vigilância AI. Sem correntes legal precisam ser aplicadas, embora o congelamento das amostras é recomendado sempre que possível. A poucos dias de temperatura ambiente, por exemplo durante o transporte para o laboratório, não foram um problema para as moléculas de RNA em cartões FTA, enquanto os cartões permaneceu seco. Outros sistemas não-refrigerado de armazenamento que estão atualmente avaliadas pela comunidade de pesquisa, como o álcool de 15 ou 16 de guanidina, exigem arranjos especiais de transporte devido à sua natureza perigosa. Em contraste, o método do cartão FTA não requer o transporte de materiais perigosos. No entanto, outro meio de armazenamento interessante a esse respeito é RNAlater ™ que não é perigoso, ou 17. Análise da amostra pode ser realizada em qualquer laboratório padrão molecular. Nenhum equipamento especial que não seja usual para as reações PCR e seqüenciamento capilar foi necessário. Todas as etapas poderiam ser realizadas sem um nível de biossegurança, pois já na coleta de amostra do potencial de agentes patogênicos foram inativadas pela atividade antibacteriana e antiviral do cartão FTA. Contaminação cruzada e subsequente amostras com falsos positivos não foram observados em nossos ensaios com amostras de aves selvagens. No entanto, quando se trabalha com RNA e PCR é sempre aconselhável prestar atenção especial para limpar locais de trabalho e salas separadas para as etapas pré e pós-PCR. Trabalhando em um exaustor diminui o risco de contaminação de aerossóis no laboratório. Pipetagem precisa ser realizado com pontas com filtro. A partir de um estudo anterior em amostras colhidas simultaneamente a partir do patos mesmo sabemos que seis das 84 amostras foram positivas pela RealTime tradicional método de RT-PCR 24 e os valores de Ct RealTime RT-PCR são conhecidos. As duas amostras positivas detectadas pelos nossos tronco método de patos que tinham valores Ct &lt;30 (indicando uma alta concentração de RNA viral). As outras quatro amostras que foram positivas com o protocolo tradicional tinha valores Ct&gt; 30 (menos concentrada) e não poderia ser detectado por nosso protocolo. Apenas amostras de vírus com títulos relativamente altos foram positivos em nosso ensaio e é provável que a sensibilidade do método foi a fonte de falha para detectar todas as amostras positivas. Além disso, o tamanho da amostra do presente estudo foi muito baixa eo método pode ser completamente desenvolvida e avaliada se mais experimentos controlados e rigorosos são realizados. No entanto, se estas amostras teriam sido coletados de uma área remota, a análise tradicional não teria sido possível a todos. Além disso, esses primeiros resultados derivam de experiências-piloto que necessitam de otimização. Um período de dois anos de armazenamento em freezer -20 ° C regulares após a coleta da amostra, provavelmente, também afetou a qualidade do RNA viral. Esta degradação RNA possível é uma questão importante quando se lida com o armazenamento em temperatura ambiente de vírus inativado. Amostras armazenadas em líquidos alternativos, como mencionado acima sofrem de significativa degradação que afeta a análise de trechos mais longos do genoma viral 16. Apesar de não ser testado em nosso estudo, cartões FTA provaram ser bem adequada para preservar as moléculas de RNA intactas em outros sistemas de RNA, que são muito semelhantes aos vírus da gripe aviária 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente ou instrumento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Plástico rayon secas swab </td><td> Copan, Itália </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA cartão </td><td> Whatman </td><td></td><td> várias opções </td></tr><tr><td> Harris micro punch de 2mm com esteira </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase livre 96well placa </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> ou comparáveis </td></tr><tr><td> Kim precisão wipes </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA solução de extracção rápida </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 kit de isolamento viral </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One Step-Access RT-PCR sistema </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> ou comparáveis </td></tr><tr><td> Agarose MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> multiusos agarose </td></tr><tr><td> Tampão de carregamento 5x </td><td> BioRad </td><td></td><td> entregue com escada de DNA </td></tr><tr><td> Carga EZ 100 bp ladder </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> ou comparáveis </td></tr><tr><td> Brometo de etídio 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> ou comparáveis </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de reacção </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> ou comparáveis </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel DNA kit de recuperação </td><td> Zymo Research </td><td> D4001 </td><td> ou comparáveis </td></tr><tr><td> ABI grande corante 3,1 química </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> ou comparáveis </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

Vírus da gripe aviária (AIVs) infectar muitos mamíferos, incluindo seres humanos 1. Estes AIVs são diferentes em seus hospedeiros naturais, abrigando quase todos os possíveis subtipos virais 2. As pandemias de gripe humana originalmente derivam AIVs 3. Muitos casos humanos fatais durante os surtos de H5N1 nos últimos anos foram relatados. Ultimamente, uma cepa nova AIV relacionadas varreu a população humana, causando quatro a &#39;epidemia de gripe suína &quot;. Apesar de a negociação humanos e atividade de transporte parece ser responsável pela disseminação de cepas altamente patogênicas 5, a dispersão também pode ser parcialmente atribuída a aves selvagens 6, 7. No entanto, o reservatório real de todas as cepas AIV é aves selvagens. Em reação a isso e em face de graves perdas comerciais na indústria avícola, programas de vigilância de grande porte têm sido implementadas globalmente para coletar informações sobre a ecologia das AIVs, e instalar sistemas de alerta precoce para detectar certas cepas altamente patogênicas 8-12. Métodos tradicionais requerem virológica vírus para estar intacto e cultivadas antes da análise. Isto exige estrita cadeias de frio, com freezers e procedimentos de biossegurança pesada de estar no lugar durante o transporte. Vigilância de longo prazo é, portanto, normalmente restrita a um campo de poucos postos de perto de laboratórios bem equipados. Áreas remotas não podem ser amostrados a menos procedimentos logisticamente complicado são implementadas. Estes problemas foram reconhecidos 13, 14 e o uso de armazenamento e estratégias alternativas de transporte investigados (álcoois ou guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 introduziu um método para coletar, armazenar e transportar amostras AIV, com base em um papel filtro especial. FTA cards 19 preservar RNA em uma base de armazenamento seco 20 e tornar inativa patógenos em contato 21. Este estudo mostrou que os cartões FTA pode ser usado para detectar AIV RNA na transcrição reversa-PCR e que o cDNA resultante poderia ser seqüenciado e genes de vírus e determinada. No estudo de Kraus et al. 18 um laboratório isolado de AIV foi usado, e as amostras foram tratadas individualmente. Na extensão aqui apresentados, as amostras de fezes de aves selvagens da armadilha pato no pássaro Ottenby Observatory (SE Suécia) foram testadas diretamente para ilustrar a utilidade dos métodos em condições de campo. Captura de patos e coleta de amostras de swab cloacal é demonstrada. O protocolo atual inclui up-scaling do fluxo de trabalho de manipulação de tubo único para um projeto de 96 poços. Embora menos sensível do que os métodos tradicionais, o método de FTA cards fornece um excelente complemento para sistemas de vigilância de grande porte. Ele permite a coleta e análise de amostras de qualquer lugar do mundo, sem a necessidade de manutenção de uma cadeia fria ou normas de segurança no que diz respeito ao transporte de reagentes perigosos, como o álcool ou guanidina.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved at JoVE.com

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Um método para preservar, detectar e seqüência de RNA a partir de vírus da gripe aviária foi validado e estendido usando naturais amostras de fezes de pássaros. Esta técnica elimina a necessidade de manter uma corrente fria e manipulação de vírus infeccioso e podem ser aplicados em uma instalação de 96 poços de alto rendimento.

Vigilância da gripe aviária com FTA Cards: Métodos de campo, de Biossegurança, e questões de transporte Resolvido

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K visualizações.  Wageningen University. Um método para preservar, detectar e seqüência de RNA a partir de vírus da gripe aviária foi validado e estendido usando naturais amostras de fezes de pássaros. Esta técnica elimina a necessidade de manter uma corrente fria e manipulação de vírus infeccioso e podem ser aplicados em uma instalação de 96 poços de alto rendimento.

Vídeo: Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Diagnóstico rápido de vírus da gripe aviária em aves selvagens: o uso de um Portable rRT-PCR e liofilizados Reagentes no Campo

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.