Um aumento nas recentes epidemias, como zika e ebola, destacou a necessidade de uma resposta mais coordenada e ágil em escala global. Para isso, projetamos uma unidade de laboratório inovadora, escalável e intramodal para ser usada em áreas restritas a recursos em todo o mundo durante esses surtos. Aqui apresentamos nossos laboratórios de contêineres intramodal, expansível e móvel.
E no artigo a seguir, apresentamos nossa abordagem BSL-2 e BSL-3 para o diagnóstico do vírus da gripe respiratória. Diagnóstico rápido do vírus da influenza por RCT-PCR. Antes de se preparar para entrar na unidade de laboratório instalada, esteja ciente de que todos os requisitos de segurança BSL-2 devem ser contabilizados.
Isso inclui vestir-se com equipamentos de proteção individual adequados, lavar as mãos, usar luvas e descontaminar quaisquer espaços de trabalho que você planeja usar. Note que, se você usar alvejante para descontaminar seu espaço de trabalho e suprimentos, você também deve usar 70% de etanol para limpar todas as áreas expostas ao alvejante, pois a alvejante pode se misturar com outros produtos químicos no espaço de trabalho para criar vapores tóxicos. Descarte todos os produtos alvejantes em sua própria lixeira designada.
À medida que os amostras são retiradas dos pacientes, elas são transportadas para o laboratório do campo ou clínica e passadas para o técnico de laboratório através da janela de passagem. Esta janela não pode ser aberta de ambos os lados. Na janela de passagem BSL-2, a superfície externa dos tubos contendo amostras deve ser completamente desinfetada com alvejante e deixada sozinha para sentar por dois minutos.
Abra a janela de passagem e colete as amostras a serem registradas. Limpe todas as amostras que tenham restos de alvejante, e limpe o interior da janela de passagem com alvejante, seguido de solução de 70% de etanol. Adicione códigos de barras a cada tubo de amostra e seus quatro tubos vazios designados para alíquotas.
Mova suas amostras para o capô da ventilação. Escaneie o código de barras em cada tubo e certifique-se de que as informações adequadas de identificação da amostra são exibidas no sistema baseado em tablet ou na tela do laptop. Completar o processo de inscrição.
Alíquota de amostra. Uma vez rotulados tubos de ensaio, use um armário de biossegurança classe II certificado e descontaminado para colher alíquotas de amostras. Ao tomar alíquotas, certifique-se de usar pipetas frescas estéreis ou descartáveis para cada amostra e descartá-las em recipientes de resíduos de risco biológico, a fim de evitar contaminação cruzada.
Certifique-se de que todos os tubos estão bem selados e fechados. Utilize uma alíquota por amostra para extração imediata. Guarde quaisquer outras alíquotas no congelador para uso futuro.
Antes de se deslocar para a estação de trabalho, limpe todas as superfícies e equipamentos do espaço de trabalho com alvejante seguido de solução de 70% de etanol. Uma vez que suas amostras de PCR com código de barras tenham sido alitadas, mova-as para uma estação de trabalho designada para extração. Prepare a mistura de RNA da operadora AVL tampão para a etapa de lise.
A mistura mestre de amostra e tampão de lise deve ser mantida em temperatura ambiente. Rotule um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Coloque a ponta da pipeta em 560 microliters.
Aplique uma ponta de pipeta limpa. Adicione um tampão de lise a cada tubo. Descarte a ponta no recipiente de resíduos.
Em seguida, pegue sua amostra de alíquota de cpr. Coloque-o no tubo tampão de lise preparado designado para aliquot um, e repita isso para quaisquer amostras adicionais. Descarte a ponta da pipeta velha e aplique uma ponta de pipeta limpa.
Aplique uma ponta de pipeta limpa. Adicione 140 microliters de um tampão ao tubo de controle. Feche cada tubo com segurança.
Vórtice de pulso por 15 segundos. Repita com quaisquer alíquotas ou amostras adicionais. Microcentrifuugar cada amostra por cinco segundos.
Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Após 10 minutos, centrifufique brevemente seus tubos para remover quaisquer gotas do interior da tampa de cada tubo. Adicione 560 microliters de etanol a amostra.
Troque sua ponta de pipeta. Repita com quaisquer amostras restantes ou adicionais. Feche cada tubo de amostra com segurança.
Vórtice de pulso cada amostra por 15 segundos. Microcentrifuugar as amostras por cinco segundos. Obtenha um tubo de coleta de dois mililitros limpos.
Adicione as colunas de giro. Rotule-as para combinar com suas amostras. Transfira 630 microliters da amostra para corresponder à coluna em conformidade.
Segurem suas tampas. Mova-se para a centrífuga. Distribua uniformemente suas amostras na centrífuga.
Centrifugar a 6000 g's por um minuto para remover o tampão de lise. Volte para a estação de trabalho. Substitua seus tubos de coleta.
Adicione o tampão de lise restante e repita a etapa de centrifugação. Descarte os tubos originais de amostra de alíquota, após os quais, elimine o elunato e lave a coluna de giro com o buffer AW1. Repita este procedimento com cada amostra ou qualquer amostra adicional.
Fixar as tampas em cada amostra e centrífuga a seis g's. Repita com o segundo tampão de lavagem AW2 a 20 g's. Por fim, coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mililitro.
Abra a coluna e adicione 60 microliters de ave tampão. Incubar em temperatura ambiente por um minuto e centrífuga a seis g's por um minuto. A amostra está pronta para análise de PCR.
Sob as condições BSL-3, o protocolo experimental permanecerá o mesmo, mas as medidas de segurança terão precedentes acima de qualquer outra coisa. Antes de entrar no laboratório BSL-3, olhe através da janela transparente para ter certeza de que a pressão negativa foi estabelecida na unidade de porta-luvas. Será evidente que a pressão negativa foi estabelecida quando a bola na parede é visível.
Uma vez estabelecida pressão negativa abra a porta e entre na unidade. Lave imediatamente as mãos e, em seguida, prossiga para a lista de verificação de EPI. Prossiga para colocar o EPI na seguinte ordem: sob luvas, vestido, capas de sapato, máscara, escudo facial, segundo par de luvas.
Ligue a máquina e deixe a pressão no porta-luvas estabilizar. Use uma solução de spray de alvejante para descontaminar todas as áreas e suprimentos que você planeja usar dentro e fora do porta-luvas. Descarte quaisquer resíduos de alvejante em um recipiente somente para alvejante.
Use uma solução de 70% de etanol para limpar em qualquer área onde o alvejante tenha sido usado. Transfira suas amostras pela janela de passagem. As amostras devem ter sido pulverizadas com solução de alvejante e deixadas sozinhas por pelo menos um minuto no pass-through antes de recebê-las dentro da unidade BSL-3.
Em seguida, receba suas amostras dentro da unidade BSL-3 e limpe-as completamente antes de prosseguir para a etapa de registro e rotulagem. Uma vez que as amostras sejam registradas e os tubos sejam rotulados, coloque as amostras no porta-luvas através da bandeja da câmara de ar. Não abra as duas portas ao mesmo tempo.
Abra e feche cada porta em duas etapas diferentes para precauções de segurança. Uma vez que as amostras tenham sido movidas com segurança para o interior do porta-luvas, siga os mesmos passos descritos anteriormente para criar alíquotas de amostra no porta-luvas. Uma vez que as amostras são aliquosas mova as amostras para o recipiente hermético.
Solução de alvejante spray dentro do porta-luvas para descontaminar tubos e todas as outras superfícies. Espere cinco minutos e, em seguida, aplique 70% de solução de etanol para lavar o alvejante. Após a descontaminação completa, mova apenas as amostras necessárias para a análise do PCR para a lise, voltem para o porta-luvas.
No porta-luvas realizar apenas a etapa de lise do procedimento de extração. Uma vez que as células tenham sido liseadas, sele firmemente as tampas de cada amostra e coloque-as na passagem de câmara de ar pressurizada. Descontaminar o porta-luvas novamente com alvejante seguido de solução de 70% de etanol.
Mova as amostras para fora do porta-luvas e transfira-as para a estação de trabalho para as etapas restantes do procedimento de extração. Após a extração, transfira suas amostras para a janela de passagem para análise de PCR. Depois que as amostras tiverem sido removidas e transferidas, descontamine seu espaço de trabalho de laboratório fora do porta-luvas.
Antes de remover seu EPI, aguarde até que a circulação de ar na unidade tenha atingido com segurança um número adequado de ciclos de filtragem antes de começar a remover seu EPI. Imediatamente após a remoção e eliminação de todos os EPI no recipiente de resíduos PPE, proceda à lavagem das mãos na pia do laboratório com água e sabão antes de sair da unidade. Amplificação e detecção do PCR.
Remova as amostras de RNA extraídas da janela de passagem. Prepare uma mistura mestre em um tubo de 1,5 mililitro com os seguintes componentes para cada ensaio direcionado: água, primers e sondas, mistura de ataque e tampão 2X. Vórtice e gire sua mistura mestre, depois disso, aliquot a mistura mestre em cada um dos tubos de tira.
Devolva o kit PCR ao armazenamento nas temperaturas recomendadas assim que a mistura principal tiver sido preparada. Adicione as amostras a cada um dos tubos de tira usando uma ponta separada entre cada tubo de tira. Gire as amostras a 1.500 rpm por um minuto, após a qual as amostras estão prontas para serem carregadas na unidade PCR em tempo real.
Uma vez que as amostras são carregadas no instrumento PCR, leva aproximadamente 90 minutos para completar uma execução. O ensaio PCR em tempo real é um método sensível para detecção robusta do vírus. Isso pode ser visto na tabela rotulada:Resultados Analisados por PCR.
Antes de coletar seus resultados e sair do laboratório, remova o EPI e descontamine adequadamente cada estação de trabalho em preparação para o próximo teste diagnóstico. Resultados representativos. O fluxo de trabalho laboratorial está representado no diagrama que enfatiza a proteção pessoal.
O teste de diagnóstico rápido da gripe é realizado através da análise RT-PCR. O procedimento consiste em quatro etapas principais e espaços de trabalho individuais são atribuídos para cada etapa do protocolo. O objetivo deste projeto é validar uma nova instalação de laboratório modular rapidamente implantável e temos feito isso com sucesso, bem como desenvolver programas de treinamento para pessoal de laboratório que trabalha em ambientes de baixos recursos durante epidemias e surtos.
