Suportada pelo National Institutes of Health (NIDCD, P30-DC010754, T32-DC009401).

1. Pré / pós-treinamento Recordings <ol><li> Iniciar o monitoramento ultra-som com Avisoft Recorder usando a configuração mostrada na Figura 2. </li><li> Vocalizações ultra-som pode ser monitorado, ou visualmente, observando o espectrograma em tempo real, ou sonoros com fones de ouvido conectado à interface de gravação ultra-som. </li><li> Coloque um sexualmente receptiva rato (no cio) do sexo feminino na gaiola do rato sujeito masculino. Sinais de estro incluem ouvido lordose, wiggling, rápida e arremessando. Fêmeas em estro obter mais vocalizações dos machos do que fêmeas não-sexualmente receptiva. </li><li> Depois que o macho tem mostrado interesse no sexo feminino (por exemplo, cheirar, perseguindo, e / ou montagem), retire a fêmea e gravar vocalizações do macho por 1-2 minutos. </li><li> Se o macho não vocalize imediatamente, voltar brevemente o rato fêmea para gaiola do macho em casa para estimular a vocalização. </li></ol> 2. Treinamento Vocal <ol><li> Iniciar o monitoramento ultra-som com Avisoft Recorder usando a mesma configuração mostrada na Figura 2. </li><li> Coloque o rato macho em sua gaiola casa sob o microfone. </li><li> Colocou um rato fêmea na gaiola do macho para casa. Como dito anteriormente, o rato fêmea deve estar no cio para maximizar a resposta vocalização do macho. </li><li> Uma vez que o macho tem mostrado interesse em remover a fêmea a fêmea. </li><li> Imediatamente após o macho produz a vocalização alvo, recompensa simultaneamente com um clique caneta e uma breve apresentação da garrafa de água ou tratamento de alimentos. Inicialmente, qualquer 50 kHz Frequência de chamada (Figura 5B) modulada é recompensado. Como o treinamento progride apenas strings cada vez mais complexas de chamadas, tais como cordas de 5 a 10 chamadas em rápida sucessão, são reforçadas. </li><li> Continue a sessão de treinamento até que você tenha dado 30 reforços. Isso normalmente demora entre 5-10 minutos. </li></ol> 3. Preparação para Análise Acústica <ol><li> Sempre arquivar os arquivos de som original e fazer edições e medições em uma cópia de trabalho, como a análise exigirá filtragem e apagar o ruído de cada arquivo. </li><li> Usando o modo de lote de Avisoft SASLab Pro, filtro de alta freqüência todos os arquivos de som para ser analisada a 25 kHz para remover ruídos indesejados abaixo do vocalizações ultra-sônica. </li><li> A fim de utilizar o recurso de detecção automática de SASLab Pro, o limiar de ruído deve primeiro ser determinado. Para fazer isso, abra um arquivo de som e criar um espectrograma usando as configurações mostradas na Figura 3. </li><li> O parâmetro de visualização automática de medições devem ser configurados de acordo com as configurações mostradas na Figura 4. </li><li> Encontrar uma área de espectrograma onde não há chamadas ou ruídos, este é o ruído de fundo. </li><li> Usando o &quot;automático (único limiar)&quot; opção, definir o limite na seção de separação Elemento da caixa de diálogo Parâmetro Medições automáticas de configuração para um pouco acima do ruído de fundo, ajustando a linha preta na janela de espectro de potência acima do espectrograma. Na Figura 4, o limite foi definido para -55 dB. </li><li> Na parte inferior da caixa de diálogo, defina o &quot;Rejeitar se amplitude de pico é inferior a&quot; valor para 1 dB abaixo do limiar encontrado no passo anterior. Esses dois valores devem agora ser usado para todos os arquivos de som analisados, assumindo todas as configurações de gravação foram os mesmos. </li></ol> 4. Identificação vocalização <ol><li> Para rotular as vocalizações usando o limite automático acima referidos, primeiro criar um espectrograma com as configurações acima. </li><li> Manualmente apagar qualquer ruído que atenda aos seguintes critérios: 1) tem sido erroneamente identificado como vocalização, 2) está afetando a discriminação do início e / ou no final da vocalização, e / ou 3), foi erroneamente identificada como a mais alta ou menor freqüência na vocalização (indicado pelas linhas superior e inferior vermelha, respectivamente). Alternativamente, os tempos de start / stop dos rótulos de vocalização pode ser ajustado manualmente após a criação de etiquetas permanentes no passo 4.5. Ruído que afetam as medições de freqüência de alta e baixa, no entanto, devem ser manualmente apagados. </li><li> Em alguns casos, uma vocalização não será capaz de ser separado do ruídos circundantes, tais como o som de cama durante a locomoção. Nestes casos, a chamada não pode ser precisamente analisados ​​e devem ser apagados. </li><li> Uma vez que todas as vocalizações foram identificados, apagar permanentemente as seções excluído do espectrograma do arquivo de som, selecionando &quot;Remove seções espectrograma apagado da onda ...&quot; no Ferramentas menu drop-down. Se este comando não é executado antes do espectrograma está fechado, todo o trabalho de apagar será perdido. </li><li> Criar etiquetas permanentes no arquivo de som clicando no botão &quot;Editar&quot; na seção Separação Elemento da janela de configuração automática de parâmetros Medições. </li><li> Visualmente e auditivamente analisar cada vocalização rotulados para determinar a sua categoria: de freqüência, simples modulada (FM), ou harmônica. Burroign o rótulo apropriado usando a pré-definidos texto módulos. Exemplos de cada categoria de vocalização são mostrados na Figura 5. </li><li> Fechar o espectrograma, salve o arquivo de som, e continuar com o arquivo de som próximo a ser analisado. </li></ol> 5. As medições acústicas <ol><li> Depois de vocalizações em todos os arquivos de som foram identificados, use a ferramenta de processamento em lote (Ferramentas: Batch Processing) para medir os parâmetros acústicos de todos os arquivos. </li><li> Na caixa de diálogo Batch processamento, selecione &quot;Medidas de parâmetros automático&quot; no menu drop-down. </li><li> Selecione o &quot;processo de todos os arquivos na pasta selecionada&quot; checkbox e clique em &quot;pasta&quot; e selecione a pasta onde os arquivos de som são salvos. </li><li> Clique em &quot;Iniciar&quot; e cada arquivo será automaticamente analisado de acordo com as últimas configurações usadas na caixa de medição automática de parâmetros de diálogo de configuração. </li><li> As medições serão salvos em um arquivo de texto que pode ser definida de acordo com os Parâmetros DDE / Log comando configuração do arquivo. Este arquivo texto pode ser importado para um programa de análise estatística. </li></ol> 6. Resultados representativos: Vocalizações ultra-sônicos de ratos são afetados por mudanças fisiológicas associadas ao envelhecimento e 6-OHDA modelos doença de Parkinson 13 Normalmente, vemos uma redução na qualidade das vocalizações ultra-som caracterizado por uma redução dos seguintes parâmetros acústicos quantitativos:. Largura de banda, freqüência de pico, duração e intensidade. A Figura 6 mostra as vocalizações freqüência modulada de um rato no modelo de PD em três momentos diferentes: basal, após a indução da DP, e depois do treino de vocalização. Na condição de PD, a chamada mostra uma redução na largura de banda, intensidade, duração e. Além disso, a modulação de freqüência tornou-se irregular. Para além da degradação de determinados parâmetros acústicos, observamos também menor complexidade geral nos tipos de vocalizações produzida nos ratos idosos e parkinsonismo. Por exemplo, após a indução da PD um rato produz um maior número de chamadas simples e menos chamadas de frequência modulada. Vocalização de treinamento seguintes, muitos parâmetros acústicos, tais como duração e intensidade, os níveis basais de aproximação e aumenta o número de complexas chamadas (Figura 6). Ratos idosos manifesta degradação dos parâmetros acústicos semelhantes em suas vocalizações ultra-sônica. Estamos investigando os efeitos do treinamento vocal em ratos idosos. <img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Número de vocalizações por sessão (alvo cumpridas por todos os ratos a cada semana) e taxa de vocalização (média e erro padrão mostrado) tanto o aumento ao longo de um período de treinamento de 6 semanas em um grupo de dois jovens (9 meses) e velhos (32 mo) ratos Fischer 344/Brown Noruega F1. <img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 vocalizações representante de cada uma das três categorias de vocalizações 50 kHz;. (A) simples, (B) freqüência modulada, e (C) harmônica. <img src="/files/ftp_upload/2835/2835fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representante freqüência modulada vocalizações a partir de um único rato em (A) base, (B) indução pós-PD, e (C) após a formação de vocalização.

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	<li>Fox, C. M., Morrison, C. E., Ramig, L. O., Sapir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+on+the+Lee+Silverman+Voice+Treatment+(LSVT)+for+individuals+with+idiopathic+Parkinson+disease.">Current perspectives on the Lee Silverman Voice Treatment (LSVT) for individuals with idiopathic Parkinson disease.</a> Am J Speech Lang Pathol. 11, 111-123 (2002).</li><li>Roy, N., Stemple, J., Merrill, R. M., Thomas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+voice+disorders+in+the+elderly:+preliminary+findings.">Epidemiology of voice disorders in the elderly: preliminary findings.</a> Laryngoscope. 117, 628-633 (2007).</li><li>Ramig, L. O., Sapir, S., Fox, C., Countryman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+vocal+loudness+following+intensive+voice+treatment+(LSVT)+in+individuals+with+Parkinson's+disease:+a+comparison+with+untreated+patients+and+normal+age-matched+controls.">Changes in vocal loudness following intensive voice treatment (LSVT) in individuals with Parkinson's disease: a comparison with untreated patients and normal age-matched controls.</a> Mov. Disord. 16, 79-83 (2001).</li><li>Sapir, S., Ramig, L. 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Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Política de Saúde Pública Serviço de Atenção Humanitária e Uso de Animais de Laboratório, a guia de NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, eo ato de bem-estar animal. O protocolo de uso de animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Wisconsin-Madison School of Medicina e Saúde Pública.

Vocalizações ultra-sônicas em ratos parecem ser vulneráveis ​​ao envelhecimento e doença processos, tais como a doença de Parkinson. Estas vocalizações ultra-sônicas fornecer um modelo de comportamento da função vocal, incluindo déficits que acompanhar as mudanças fisiológicas, devido a doenças e envelhecimento. Além disso, mudanças acústico em vocalizações ultra-sônicas são facilmente medidos e quantificados. Além disso, vocalizações ultra-som pode ser modificada através de intervenções comportamentais. Portanto, vocalizações ultra-sônicas rato fornecer um modelo útil para estudar o impacto da doença, envelhecimento e intervenções terapêuticas em ambos os comportamentos e mecanismos neurobiológicos subjacentes. Nosso método de treinamento vocal usa um estímulo condicionado (um clique) associado a um reforço positivo (recompensa tratar a água ou comida). O clique em seguida a recompensa é usada para reforçar vocalizações de complexidade crescente. Nós definimos vocalizações complexas como as que contêm um &quot;trinado&quot; (frequência modulada) componente (Figura 5B) versus aqueles que são &quot;flat&quot; e manter uma única freqüência (Figura 5A). Este componente de freqüência modulada é facilmente identificado por sua aparência senoidal. Enquanto 50 kHz-vocalizações podem ser inteiramente sinusoidal (Figura 5B), é comum encontrar mais complexa 50 kHz-vocalizações, que consistem em parte deste componente de freqüência modulada, bem como quer grandes saltos em freqüência ou um componente breve plana. Estas vocalizações mais complexas podem ter pequenos intervalos de menos de 10 ms entre os componentes, mas são considerados uma vocalização única. Embora mais detalhada sub-classificação destas vocalizações é possível offline, nós classificamos todos os 14 vocalizações de 50 kHz contendo um componente de freqüência modulada tão complexo para reduzir a necessidade de classificação subjetiva on-line e reduzir a variabilidade de reforço. Em seu próprio laboratório, é importante escolher como os dados são classificados e analisados ​​de acordo com um projeto de estudo que é apropriado para o propósito do estudo. Há muitos fatores a considerar quando se usa esse protocolo. Primeiro de tudo, apesar de homogeneidade genética e consistência processual, os ratos têm uma resposta variável ao treinamento. Alguns ratos naturalmente vocalize mais do que outros, 5 ou são motivados por exposição a uma mais mulheres do que por uma recompensa de comida ou água. Uma maneira de explicar essa variabilidade é examinando a alteração dos parâmetros acústicos de vocalizações ratos individuais &quot;linha de base para a sua pós-lesão e pós-treinamento vocalizações. Embora não discutido neste protocolo, também temos ensaios comportamentais para quantificar o interesse na mulher, tais como a latência para montar. Além disso, dependendo da idade e nível de atividade de um rato individual, uma parte superior dos fios pode ser necessária na gaiola durante o treino para evitar fugas. Apesar da variabilidade individual, temos utilizado com sucesso este protocolo em uma variedade de linhagens e idades para melhorar vocalizações em relação à linha de base cada rato indivíduo. Ratos são sensíveis a mudanças aparentemente pequenas no meio ambiente, tais como aromas, a temperatura, e pessoal. Um esforço deve ser feito para evitar scented produtos de cuidados pessoais, tais como loções, produtos de cabelo e perfumes. Antes de tentar a formação, o indivíduo deve ser confortável e interagindo com manipulação de ratos. Além disso, as inconsistências de pessoal ou de ambiente pode afetar a resposta dos ratos de vocalização. Porque os ratos são noturnos, eles devem ser mantidos em um ciclo de luz revertida para permitir a formação a ter lugar durante a parte escura do seu ciclo de quando eles estão mais ativos. Nós iluminar a nossa sala de treinamento com luzes vermelhas. Além disso, se uma recompensa a água é utilizada durante o treinamento, os ratos devem ter acesso restrito à água. Nossos ratos são água restrito a 21 horas antes da sessão de treinamento. Três horas de exposição à água foi determinada pelo nosso Animal Care Use Institucional e Comitê para ser o período mínimo de tempo restritivas que permitiu que a água para ser útil como reforço em nossos estudos comportamentais sem apresentar um compromisso substancial para a saúde animal ou bem-estar. Ratos têm acesso à água em momentos aleatórios (10 minutos a 30 minutos) após o treinamento e, posteriormente, têm livre acesso à água por três horas durante a parte escura do seu ciclo de luz. Ratos devem ser inspecionados diariamente para detectar sinais de desidratação e pesava todos os dias para garantir que não haja perda de peso significativa (superior a 10%). A restrição alimentar não é necessário se utilizar um tratamento de alimentos como uma recompensa. Trata específicos para ratos estão comercialmente disponíveis, mas temos encontrado um pequeno pedaço de um cereal com açúcar a ser uma recompensa eficaz. Como mencionado acima, ratas em estro obter uma resposta maior vocalização dos machos do que fêmeas não-sexualmente receptiva. Através da manutenção de um grande número de mulheres na colônia, há uma grande probabilidade de que apelo menos uma fêmea no cio será em um determinado dia. No entanto, o estro também pode ser farmacologicamente induzida em ratas por via subcutânea injetar 10 mg de β-estradiol em 0,1 cc estéril de óleo de gergelim 48 horas antes do treino seguido por 500 mg de progesterona em 0,1 cc de óleo de gergelim estéril quatro horas antes do treino. Além disso, os ratos do sexo masculino que são ingênuo ratas devem ser sexualmente experientes antes do treinamento vocal. Isto é conseguido colocando uma ratazana que está exibindo sinais de receptividade sexual (dardo, lordose ouvido, balançando) na gaiola do macho em casa até as montagens do sexo masculino e ejacula. Os machos não podem montar durante as primeiras sessões ea fêmea podem ser removidos após o interesse do sexo masculino mostra na mulher por cheirar e / ou perseguindo a fêmea ao redor da gaiola. Sexualmente experimentando é feito uma vez ao dia por duas semanas. Este período de tempo também fornece uma oportunidade para ratos habituar ao experimentador (s) e sala de gravação. Uma limitação deste método é a determinação subjetiva do tipo de vocalização. Além disso, esse fator limita a velocidade de coleta de dados, já que cada chamada deve ser independente examinados e classificados manualmente. Relacionado a isso está a importância de ter avaliadores experientes, que têm sido constantemente treinados na identificação de vocalização. A confiabilidade intra e inter-avaliador deve ser avaliada dentro do seu próprio laboratório. Em resumo, vocalizações ultra-sônicas em roedores são utilizados em muitos modelos diferentes para estudar as relações cérebro-comportamento, incluindo estados emocionais, recompensa e vício, e estados de doença, como o autismo. 6,14-16 método Este romance é uma forma de estudar a mecanismos subjacentes alvo de treinamento vocal para o tratamento de déficits de voz no envelhecimento e na Doença de Parkinson. Este método tem o potencial de ser aplicado a modelos de outras doenças que afetam a comunicação e voz.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Condensador de ultra-som do microfone CM16/CMPA </td><td> Bioacústica Avisoft </td><td> 40011 </td></tr><tr><td> UltraSoundGate 116Hb </td><td> Bioacústica Avisoft </td><td> 41161 </td></tr><tr><td> Avisoft-RECORDER </td><td> Bioacústica Avisoft </td><td> 10201 </td></tr><tr><td> Avisoft-SASLab Pro </td><td> Bioacústica Avisoft </td><td> 10101 </td></tr></tbody></table>

targeted training of ultrasonic vocalizations in aged and parkinsonian rats

Déficits de voz são uma complicação comum de ambos doença de Parkinson (PD) e do envelhecimento, pois eles podem diminuir significativamente a qualidade de vida, impactando habilidades de comunicação 1, 2 acções de formação específicas (fala / terapia voz) pode melhorar déficits específicos de voz, 3, 4, embora o. mecanismos subjacentes das intervenções comportamentais não são bem compreendidos. Investigação sistemática de déficits de voz e terapia deve considerar muitos fatores que são difíceis de controlar em humanos, tais como idade, ambiente familiar, idade pós-início da doença, gravidade da doença e medicamentos. O método apresentado aqui usa um modelo animal de vocalização que permite o estudo sistemático de como mudar os mecanismos subjacentes sensório-motora com o treinamento de voz-alvo. Os procedimentos de ultra-som de gravação e análise descrita neste protocolo são aplicáveis ​​a qualquer investigação de vocalizações ultra-sônicas de roedores. As vocalizações ultra-sônica de roedores estão emergindo como um modelo valioso para investigar os substratos neurais do comportamento. 5-8 roedores e vocalizações Ambos os humanos carregam valor semiótico e são produzidos por modificar um fluxo de ar egressive com uma constrição da laringe. 9, 10 Assim, vocalizações de roedores pode ser um modelo útil para estudar os déficits de voz em um contexto sensório-motor. Além disso, modelos de ratos nos permitem estudar os fundamentos neurobiológicos da recuperação de déficits com formação específica. Para o modelo PD usamos Long-Evans ratos (Charles River Laboratories International, Inc.) e induzir parkinsonismo por uma infusão unilateral de 7 mg de 6 hidroxidopamina (6-OHDA) no feixe medial do prosencéfalo que causa degeneração moderada a grave de pré-sináptica neurônios estriatais (ver detalhes Ciucci, 2010). 11, 12 Para o nosso modelo de envelhecimento usamos a Fischer 344/Brown Noruega F1 (National Institute on Aging). Nosso principal método para vocalizações provocando é expor sexualmente experientes ratos machos sexualmente receptiva a ratas. Quando o macho se torna interessado na fêmea, a fêmea é removida e os do sexo masculino continua a vocalizar. Recompensando vocalizações complexas com comida ou água, tanto o número de vocalizações complexas ea taxa de vocalizações pode ser aumentada (Figura 1). Um microfone ultra-sônico montado acima da gaiola do macho casa registra as vocalizações. A gravação começa após a rata é removido para isolar a chama do sexo masculino. Vocalizações podem ser visualizados em tempo real para a formação ou gravados e analisados ​​offline. Pela gravação e análise acústica vocalizações antes e após o treinamento vocal, os efeitos da doença ea restauração da função normal com o treinamento pode ser avaliado. Este modelo também permite-nos relacionar o comportamento observado (vocal) melhorias a mudanças no cérebro e do sistema neuromuscular.

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Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Distúrbios da voz são debilitantes no envelhecimento e na doença de Parkinson. As vocalizações ultra-sônicos de ratos, também afetados por essas condições, pode ser usado para estudar estes distúrbios da voz, seus substratos neurais, ea natureza da recuperação funcional com intervenção comportamental.

Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

targeted-training-ultrasonic-vocalizations-aged-parkinsonian

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.7K visualizações.  University of Wisconsin. Distúrbios da voz são debilitantes no envelhecimento e na doença de Parkinson. As vocalizações ultra-sônicos de ratos, também afetados por essas condições, pode ser usado para estudar estes distúrbios da voz, seus substratos neurais, ea natureza da recuperação funcional com intervenção comportamental.

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Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

Avaliação de vocalizações ultra-som durante Drogas auto-administração em ratos

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Neurociência

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes. As such, all behaviors manifest through the motor system. In the fields of neuroscience and orthopedics, locomotion is a commonly evaluated behavior for a variety of disease models. For example, locomotor recovery after traumatic injury to the nervous system is one of the most commonly evaluated behaviors 1-3. Though locomotion can be evaluated using a variety of endpoint measurements (e.g. time taken to complete a locomotor task, etc), semiquantitative kinematic measures (e.g. ordinal rating scales (e.g. Basso Beattie and Bresnahan locomotor (BBB) rating scale, etc)) and surrogate measures of behaviour (e.g. muscle force, nerve conduction velocity, etc), only kinetics (force measurements) and kinematics (measurements of body segments in space) provide a detailed description of the strategy by which an animal is able to locomote 1. Though not new, kinematic and kinetic measurements of locomoting rodents is now more readily accessible due to the availability of commercially available equipment designed for this purpose. Importantly, however, experimenters need to be very familiar with theory of biomechanical analyses and understand the benefits and limitations of these forms of analyses prior to embarking on what will become a relatively labor-intensive study. The present paper aims to describe a method for collecting kinematic and ground reaction force data using commercially available equipment. Details of equipment and apparatus set-up, pre-training of animals, inclusion and exclusion criteria of acceptable runs, and methods for collecting the data are described. We illustrate the utility of this behavioral analysis technique by describing the kinematics and kinetics of strain-matched young adult, middle-aged, and geriatric rats.

Locomotion is often examined as a behavioural outcome in various models of disease in fields such as neuroscience and orthopedics. This video paper intends to describe a method for collecting ground reaction forces and kinematics from rats during unrestrained locomotion.

Cinemática e terra Determinação Força de Reacção: Uma demonstração Habilidades Locomotor Quantificação da Jovem Adulto, de meia-idade, e Rats Geriátrica

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Um método geral para a avaliação de Incubação de Craving Sacarose em Ratos

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Treinamento baseado em atividade em uma esteira com medula espinhal ferido de ratos Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

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