Agradecemos Produtos ReadiSorb por seu generoso apoio desses estudos.

1. Cultura de células de astrócitos felino e tratamento com H 2 O 2 <ol><li> Linha de cultura de células G355-5 em um balão de 75 cm 2 com a mídia DMEM acrescido de nutrientes, a 37 ° C e 5% de CO 2 até confluentes 60% (~ 5 dias). Substituir a mídia a cada 1-2 dias ou quando necessário para manter uma cultura saudável. </li><li> Remova a mídia e adicionar 2 ml de tripsina 0,25%. Levante as células por pipetagem por 45 s - 1 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Rapidamente transferir a suspensão para um tubo cônico de 15 ml contendo 10 ml de mídia. Misture delicadamente. </li><li> Centrifugar a 300 xg, 23 ° C por 3 min para obter uma pelota. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar ml 6-7 de mídia fresco e ressuspender as células. </li><li> Adicionar ~ 1 ml de células para cada poço de uma placa de seis poços. Adicionar 2-3 ml de mídia para cada poço e incubar até confluentes 80-90%. </li><li> Prepare uma solução 100μM de peróxido (H 2 O 2) na mídia. </li><li> Remova a mídia de cada bem e substituir com 2 ml de mídia fresco (controle), 2 ml de H 2 O 2 (tratamento) ou 2 ml de DPBS. Incubar a 37 ° CO C, 5 2% para 3 h. </li><li> Remover soluções e adicionar 1 ml de tripsina para levantar as células. Transferência de células para um tubo Eppendorf 1,7 ml contendo 0,5 ml DPBS. Esta etapa deve ser realizada em cada poço individualmente, a fim de evitar a morte celular de incubação de tripsina prolongada. </li><li> Giram a 300 xg por 3 min, descartar o. Sobrenadante e ressuspender em 1 ml de DPBS </li></ol> 2. Coloração de ROS <ol><li> Todos os passos para a coloração deve ser realizada com a exposição à luz mínima para prevenir branqueamento. </li><li> Adicionar 1 ml de 50 mM CCCP ao controle positivo. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 5 min. </li><li> Adicionar 5 mL de uma solução de 10 mM CM-H DCFDA 2 à H 2 O 2 grupo. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 15-30 min. Sem mancha é adicionado à amostra salina. </li><li> Lavar as amostras com 2 ml de DPBS para remover mancha residual. </li><li> Giram a 300 xg por 3 min para obter uma pelota. </li><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de DPBS. Adicionar 1 mL PI para cada amostra, com exceção do soro fisiológico. </li><li> Transferência de amostras para um tubo de 5ml de fluxo citómetro. </li><li> Executar no citômetro de fluxo. </li></ol> 3. Citometria de fluxo <ol><li> Executar amostras em um Beckman Coulter FC500 (ou equivalente) equipado com um laser de argônio 488 nm ea banda passa a seguir: 525, 775 e 620 nm, todas ± 20 nm. </li><li> Prepare os controles apropriados: não coloridas, CM-H 2 DCFDA manchada apenas, PI só, manchado dupla (controle negativo). </li><li> Faça um protocolo que tem o histoplots seguinte: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Ele também deve ter os histogramas seguintes: número de células versus FL1, FL2 e FL3, o que corresponde às manchas. </li><li> Antes de executar as amostras, verificar o equipamento, fluidos e recipiente de resíduos. Aquecer o equipamento para, pelo menos, 20 min. </li><li> Limpar o equipamento e realizar uma calibração com as contas apropriadas de acordo com os padrões dos fabricantes. </li><li> Selecione seu protocolo e executar os exemplos. </li><li> Limpar o equipamento, como feito anteriormente. </li><li> Limpar a linha de vácuo acordo com as normas dos fabricantes. </li><li> Desligue o fluxo e limpar a linha da cabeça / vácuo. </li><li> Desligue o software eo computador. </li></ol> 4. Resultados representativos: Resultados de citometria de fluxo foram analisados ​​utilizando programa FlowJo 7,6 e os controles mancha foram usados ​​para objetivamente definir o gating. Com base nisso, as células saudáveis ​​aparecem à esquerda do histograma e ROS (estresse oxidativo) foi detectado como uma mudança de células para a direita. A Figura 1 mostra os resultados do efeito do peróxido de hidrogênio em astrócitos saudáveis ​​felino. Dados de FL1 foi usado para medir a intensidade da DCFDA 2 CM-H, que indica a presença de ROS. Como esperado, uma maior quantidade de ROS foi detectado na amostra tratada com H 2 O 2. Isso é exibido no histograma como uma mudança na intensidade de fluorescência da esquerda para a direita. Ao comparar as células saudáveis ​​tratados com DMEM versus DPBS, não houve mudança significativa na quantidade de ROS (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fluxo de resultados de citometria de níveis de estresse oxidativo em astrócitos saudáveis ​​felina eo efeito do H 2 O 2 em células saudáveis. Os resultados indicam que H 2 O 2 aumenta os níveis de ROS em células saudáveis, em comparação com as células sem tratamento (DMEM). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Fluxo Citometria de resultados de níveis de ROS detectado em células saudáveis ​​incubados por 3 horas com DPBS.

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	<li>Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide+synthase+activity+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+monocytes:+implications+for+HIV-associated+neurological+disease.">Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease.</a> J Exp Med. 181, 735-745 (1995).</li><li>Cadet, J. 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B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+gp120+associated+neurological+deficits:+a+potential+role+for+nitric+oxide+and+other+signal+molecules.">HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules.</a> Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).</li><li>Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+generation+of+H2O2+for+platelet-derived+growth+factor+signal+transduction.">Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction.</a> Science. 270, 296-299 (1995).</li><li>Wang, X. F., Cynader, M. 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Um mecanismo muitas vezes sugerido de vírus danos induzidos neuronal é o estresse oxidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Basicamente, propõe-se que através da exposição viral da glia (astrócitos e microglia) liberação de radicais de oxigênio reativo, tais como, hidróxido, ânion superóxido, óxido nítrico, e / ou peróxido de hidrogênio, que são tóxicos para os neurônios. Da mesma forma, o estresse oxidativo também tem sido sugerido como um mecanismo patológico em grandes metanfet...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitaminas </td><td> Cellgro </td><td> 25-020-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Hyclone </td><td> 17-605E </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Não Aminoácidos Essenciais </td><td> Hyclone </td><td> 25-025-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (v / v) </td></tr><tr><td> Aminoácidos Essenciais </td><td> Cellgro </td><td> 25-030-cl </td><td> 0,2% (v / v) </td></tr><tr><td> Sistema de filtragem a vácuo 500ml </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cônicos </td><td> Falcão </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75 centímetros de cultura de tecidos 2 frascos </td><td> Falcão </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 placa de cultura de tecido bem </td><td> Falcão </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM-H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Iodeto de propídio (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170-10mg </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Lonza </td><td> 17-160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> Sigma </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico HyQ </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0,1% (v / v) </td></tr><tr><td> G355-5 células </td><td> ATCC </td><td> CRL-2033 </td><td> Cérebro felino normal </td></tr></tbody></table>

screening assay for oxidative stress in a feline astrocyte cell line, g355-5

Um mecanismo muitas vezes sugerido de vírus danos induzidos neuronal é o estresse oxidativo. Astrócitos têm um papel importante no controle do estresse oxidativo do Sistema Nervoso Central (SNC). Astrócitos ajudar a manter um ambiente homeostático para os neurônios, assim como proteger os neurônios de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS). CM-H2DCFDA é um indicador de células-permeável para a presença de ROS. CM-H 2 DCFDA entra na célula como um composto não-fluorescente, e se torna fluorescente após esterases celulares remover os grupos acetato, eo composto é oxidado. O número de células, medido por citometria de fluxo, que são encontrados para ser fluorescentes verde é uma indicação do número de células que estão em um estado oxidativo. CM-H 2 DCFDA é suscetível à oxidação por um grande número de ROS diferente. Esta falta de especificidade, considerando que ROS pode oxidar CM-H 2 DCFDA, faz deste composto um regente valiosa para uso nas fases iniciais de uma investigação patogênese, como este teste pode ser usado para a tela para um ambiente oxidativo celular, independentemente do que o oxigênio radical ou combinação de ROS são responsáveis ​​pelas condições celular. Uma vez que foi estabelecido que ROS estão presentes por oxidação de DCFDA 2 CM-H, em seguida, experimentos adicionais podem ser realizados para determinar qual ROS ou combinação de EROs estão envolvidas no processo de patogênese particular. Os resultados deste estudo demonstram que com a adição de peróxido de hidrogênio em um aumento DCFDA 2 CM-H fluorescência foi detectada em relação aos controles salina, indicando que este teste é um teste útil para a detecção de um ambiente oxidativo dentro G355-5 células, uma linhagem celular felina astrócitos.

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Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Um método de triagem para detectar ambientes oxidativo celular é medir a oxidação do CM-H2DCFDA. Uma vez oxidada dentro de uma célula, CM-H2DCFDA muda de não-fluorescentes em um composto fluorescente. Esta mudança de fluorescência é medida por citometria de fluxo e indica o número de células em um ambiente oxidativo.

Ensaio de triagem para Estresse Oxidativo em uma linhagem de células Feline astrocitária, G355-5

An often-suggested mechanism of virus induced neuronal damage is oxidative stress. Astrocytes have an important role in controlling oxidative stress of ...

screening-assay-for-oxidative-stress-feline-astrocyte-cell-line-g355

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.3K visualizações.  Western University of Health Sciences. Um método de triagem para detectar ambientes oxidativo celular é medir a oxidação do CM-H2DCFDA. Uma vez oxidada dentro de uma célula, CM-H2DCFDA muda de não-fluorescentes em um composto fluorescente. Esta mudança de fluorescência é medida por citometria de fluxo e indica o número de células em um ambiente oxidativo.