Este trabalho foi financiado pelo Prêmio de Pesquisa Translacional CIRM precoce II TR2-01821, NIH / NIDCR (subvenções R21 DE0177711 e RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ e RKS têm T32 bolsas de formação prêmios (5T32DE007296-14), JNZ tem uma bolsa de formação CIRM (TG2-01169).

1. Isolamento de células-tronco perivascular Isto é descrito em detalhes no artigo adjacente &quot;Purificação de Células-Tronco perivasculares do tecido adiposo humano Branco&quot;, de M. Corselli et al. 2. Andaime Criação <ol><li> Os andaimes são feitos sob medida por protocolo publicado anteriormente a partir de poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA, Burmingham Polymer) com revestimento de hidroxiapatita 4-6. Andaimes apatite revestidos são fabricados a partir de PLGA 85/15 PLGA por evaporação de solvente e um processo de lixiviação em partículas. Andaimes são criados em uma forma esférica (2 mm de diâmetro) para implantação músculo bolsa, uma forma discóide (4 mm de diâmetro) para implantação calvária, ou cilíndrica (4 mm de diâmetro, 6 mm de comprimento) para femorais defeitos segmentais. </li><li> Resumidamente, PLGA / clorofórmio soluções misturadas com sacarose (polímero / rácio de sacarose 5/95, w / w) são expressos em um 200-300 mícrons de diâmetro de molde de Teflon para criar as desvantagens feitos por medidatruct. Após liofilização durante a noite, andaimes são removidos a partir do molde de Teflon e imerso em ddH2O para dissolver a sacarose. Andaimes são desinfectados por imersão em etanol a 70% durante 30 min, seguido de três lavagens da DDQ 2 O. </li><li> Para o revestimento de apatite, um corpo simulado solução de fluido (SBF) é preparado por dissolução de sequencialmente CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO3, e K 2 HPO 4 • 3H 2 O na DDQ 2 O. O pH da solução é reduzido para 6 pela adição de ácido clorídrico 1M para aumentar a solubilidade. Na2SC @ 4, KCl, e NaCl são adicionados eo pH final é ajustado para 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg2 + e HCO 3 - livre SBF (SBF 2) é preparado por adição de CaCl2 e K 2 HPO 4 • 3H 2 O na ddH2O e pH é reduzido para 6. KCl e NaCl são adicionados eo pH final é ajustado a 6,8. Todas as soluções são estéreis filtrada através de um Membr iM 0,22 PESane (Nalgene). Imediatamente antes do processo de revestimento, os suportes de PLGA secas são submetidos a descarga luminescente de árgon plasma condicionamento (Harrick Scientific) para melhorar a molhagem e uniformidade de revestimento. </li><li> Andaimes causticado são então incubadas em SBF 1 para 12 h, e alterada para Mg2 + e HCO 3 - SBF livre 2 para um outro h 12 a 37 ° C sob agitação suave. Andaimes revestidas são lavadas com ddH2O para remover o excesso de iões e liofilizado antes para estudos posteriores. </li></ol> 3. A implantação do modelo muscular Bolsa <ol><li> 100 ul de uma suspensão PSC em PBS (solução salina tamponada com fosfato) são suavemente cair sobre o implante de PLGA-Based esférica imediatamente antes da implantação. Células foram pré-rotulados por inserção lentiviral de luciferase do pirilampo, de modo a permitir in vivo após a implantação de seguimento. A densidade celular é de 2,5 x 10 5 por implante. </li><li> SCID (grave imunodeficiente combinado) ratinhos são utilizados com 6 semanas de idade. Os animais são anestesiadosthetized por inalação de isoflurano e pré-medicados com buprenorfina (Bedford Labs). Após a preparação Betadine padrão, incisões bilaterais nos membros posteriores são feitas (longitudinal e 2 mm de comprimento). </li><li> Bolsos são cortados nos músculos bíceps femoral por dissecção romba paralela ao eixo da fibra muscular longo. Para cada rato, o implante de PLGA-baseada com PSCs é inserido, e no painel frontal que cobre o músculo é suturada com 5-0 Vicryl (Ethicon). </li><li> A pele é fechada com 5-0 próxima Vicryl num padrão subcuticular. Os animais são tratados com buprenorfina no pós-operatório, durante 48 horas e TMP / SMX (Trimetoprim / sulfametoxazol; Qualitest) durante 10 dias. </li></ol> 4. A implantação do modelo calvária Defeito <ol><li> Após anestesia com isoflurano de ratinhos SCID (12-14 semanas de idade), o cabelo é cortado ea pele desinfectada com betadine por protocolo. </li><li> A incisão na pele de 8 mm é feita ao longo da sutura médio-sagital da calota mouse. Em seguida, o calvarial periósteo é gentilmente removido por Q-tip aplicação. </li><li> Em seguida, usando bits de diamante revestidos trefina em uma broca de alta velocidade dental, uma 4-milímetros defeito osso parietal é criado. O defeito é espessura total - no entanto o cuidado é tomado para não lesar a dura-máter subjacente. </li><li> O feito por medida do implante de PLGA-baseada com PSCs enxertados é então colocado suavemente no local do defeito. A densidade celular é de 2,5 x 10 5 por implante. Finalmente, a pele é suturada com 6-0 Vicryl. Os animais são tratados com buprenorfina no pós-operatório, durante 48 horas e TMP / SMX durante 10 dias. </li></ol> 5. A implantação do modelo Femoral segmentar Defeito <ol><li> Ratos atímicos (12-14 semanas de idade) são anestesiados sob inalação de isoflurano. O fêmur é limpo e preparado por protocolo padrão com betadine (Figura 1). </li><li> Uma incisão de 27-30 mm longitudinal é feita sobre o aspecto ântero-lateral do fêmur. O eixo femoral é, então, exposta através da separação da lat vastuseralis e bíceps femoral (Figura 2). </li><li> Para maximizar a consistência de regeneração óssea, o periósteo sobrejacente o defeito femoral é completamente removido com o segmento ressecado femoral. </li><li> Uma placa de polietileno (comprimento, 23 mm, largura, 4 mm, altura, 4 mm) é colocado sobre a superfície anterolateral do fémur. A placa contém seis orifícios pré-perfurados para acomodar 0,9 mm de diâmetro fios roscados Kirschner (Zimmer). Tomando a placa como um modelo, seis fios roscados Kirschner são perfurados através da placa e ambos os córtices (Figura 3). </li><li> Em seguida, com uma lâmina de serra oscilante pequena (Stryker, MI), um 6-milímetros defeito meados de diafisária é criado. Defeitos segmentais são então tratados através da inserção de implantes de PLGA base que tenham sido carregados com células como por protocolo (Figura 4). </li><li> O músculo sobrejacente e fáscia são fechados com Vicryl 4-0 suturas absorvíveis para fixar o implante no lugar, ea pele é suturada. </li&gt; </ol> 6. Testes in vivo <ol><li> Avaliações radiográficas são realizadas de forma longitudinal, tanto de alta resolução e alta resolução XR μCT (micro tomografia computadorizada) análise. Para μCT análise (SkyScan 1172F), as imagens são digitalizadas com uma resolução de 19.73 mM (100 kV e 100 mA fonte de radiação, usando um filtro de alumínio 0,5 milímetros). As imagens são analisadas utilizando DataViewer, Recon, CTAN, e softwares CTVol. </li><li> Imagiologia bioluminescência é também feito de uma forma de série para avaliar células enxerto, a viabilidade de proliferação, e não incluem a migração para fora do local do implante. Imagiologia bioluminescência é realizada utilizando um dispositivo de IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Saídas de luz são quantificados utilizando software imagem viva (Xenogen). Saída total de luz é registrada em fótons por segundo / cm ² / esterradiano. </li><li> A análise histológica e histomorfométrica é feita pós-morte. Colorações de rotina empregados incluem tricrômico de Masson, azul de anilina, pentachrome, e Picrosirius vermelho. A análise histomorfométrica é realizada facilmente com qualquer anilina azul ou manchas pentachrome, em que aparece osteóide azul escuro e amarelo, respectivamente. Pixels por campo de alta potência são calculadas usando a ferramenta varinha mágica no Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Os resultados representativos Como ambos os defeitos calvária e femoral são críticos porte, não há cura significativa deve-se esperar sem o tratamento com fatores de crescimento ou de células-tronco exógenas. Em termos de manobras cirúrgicas, a dissecção bolsa muscular deve ser ao longo dos planos fasciais e, portanto, sangramento mínimo deve ser encontrado. Mesmo que o modelo de bolsa muscular é realizada bilateralmente, o rato deveria estar andando com facilidade no dia pós-operatório 1. Para o defeito calvária, sangramento é encontrado, mas pode ser embebido com um Q-ponta. Extremo cuidado deve ser tomado para não lesar a dura-máter subjacente - como isso irá interferircom cura normal. Para o modelo de FSD, toma-se cuidado para não ferir os vasos sanguíneos principais de modo a não causar sangramento excessivo ou o nervo femoral para evitar danos neurológicos. Os fios de Kirschner são perfurados com uma ligeira pressão de modo a não danificar o osso cortical no processo. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> Figura 1. Preparo pré-operatório para defeito segmentar Femoral (FSD) em ratos atímicos. Ratos machos (12-14 semanas de idade) são anestesiados sob inalação de isoflurano. O fêmur é limpo e preparado por protocolo padrão com betadine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> Figura 2. Exposição cirúrgica para Femoral segmentar Defeito criação (FSD). Uma incisão longitudinal 27-30 milímetros é feita sobre o aspecto ântero-lateral do fêmur. O aspecto lateral do eixo femoral é, então, exposta através da separação da vasto laterale bíceps femoral. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> Figura 3. Fixação Femoral para segmentar Defeito criação (FSD). Uma placa de polietileno (comprimento, 23 mm, largura, 4 mm, altura, 4 mm) é colocado sobre a superfície anterolateral do fémur. A placa contém seis orifícios pré-perfurados para acomodar 0,9 mm de diâmetro fios roscados Kirschner. Tomando a placa como um modelo, seis fios roscados Kirschner são perfurados através da placa e ambos os córtices. Em seguida, um defeito 6 mid-diafisária milímetros é criado. Uma vez que esta é realizada, um andaime feito por medida, que está directamente inserido exactamente se encaixa no local do defeito (não mostrado). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplo de defeito ósseo craniano pós-operatória. A 4 mm, defeito circular calvária é criado no osso parietal direito em ratinhos atímicos. Imaged aqui é um local do defeito implantados comPSCs em 8 semanas pós-operatórias. Note-se a presença de osso novo dentro do local do defeito.

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	<li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li><li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs:+regenerative+units,+cytokine+sources+or+both.">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li><li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells.">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li><li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model.">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , (2010).</li><li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li><li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds.">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li><li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation.">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li><li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts.">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li><li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration.">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li><li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication:+role+of+canonical+Wnt+signaling.">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li><li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li></ol>

KT, BP e CS são inventores de perivasculares de células-tronco relacionadas com patentes depositadas pela UCLA. Drs. KT, e CS são fundadores da Scarless Laboratories Inc. que sublicenças perivasculares de células-tronco relacionadas com patentes da UC Regents. Dr. Chia Soo também seja um diretor de Scarless Laboratories, Inc.

O isolamento de PSCs é bem descrito em outro lugar 1-3, incluindo uma publicação JOVE separadamente submetidos especificamente endereçamento protocolos de isolamento PSC e métodos. O objetivo específico deste artigo é descrever e demonstrar 3 protocolos para PSC in vivo pedido de formação óssea / regeneração. A bolsa muscular SCID mouse é um modelo comumente descrito para a formação óssea ectópica humana 7. Existem diferenças importantes entre ectópicos e ortotópico (defeito) modelos para osso, incluindo a interacção com parácrina hospedeiras células formadoras de osso 8, bem como uma abundância de factores osteogénicos sinalização presentes no microambiente defeito esquelético. Dois defeitos são apresentados aqui, um defect8 calvária e defeito segmentar femoral 4. Ambos estão bem documentados para ser crítico empresas (ou seja, não vai curar a sua própria). Diferenças interessantes entre existem defeitos de calvárias e femoral. Primeiro, ocelular: interação celular entre PSCs xenografted e células endógenas é muito diferente. Em termos de um defeito calvária, PSCs interagir com a dura-máter subjacente (a camada mais externa das meninges), bem como os osteoblastos e células periosteais circunscrevem o local do defeito. Importante, a interacção entre as células implantadas e osteoblastos circundantes 8, ou células implantadas e dura subjacente (Levi et ai., No prelo) são críticos para células estaminais normais mediada osteogénese para prosseguir. Em termos do defeito femoral segmentar (FSD), PSCs xenografted são expostos a uma célula muito diferente e ambiente de citoquinas. Por exemplo, o local de FSD é composto da medula e que acompanha as células estaminais mesenquimais, bem como o endósteo, periósteo e de ossos longos osteoblastos. Teoricamente, cada célula tem sua própria reação à injúria, e cada um pode ter celular: interações celulares com xenoenxertos PSC. Outras diferenças claras entre calváriae defeitos femorais. Os ossos calvárias inicialmente formar através de ossificação intramembranosa, enquanto que os ossos longos formar através de um intermediário de cartilagem (ossificação endocondral). Além disso, o processo de reparação pós-lesão também imita estas origens de desenvolvimento. Pós-FSD, cartilagem formação de calo é observada, ao passo que nenhum intermediário cartilagem é formado dentro de um defeito do osso parietal. Finalmente, a origem embrionária do crânio podem diferir do que a dos ossos longos. A maioria do crânio (incluindo células perivasculares - pericitos - em toda a região da cabeça) é derivado a partir da crista neural (mesectoderm), enquanto o esqueleto apendicular é de derivação mesoderme paraxial 9. Todas essas diferenças podem resultar em diferenças significativas em termos de PSC-mediada reparação óssea. A utilização de PSCs tem várias vantagens sobre tradicionais derivadas de tecido adiposo células do estroma (ASC). PSCs não requerem cultura e são uma população purificada de células which não inclui outras células do estroma que não participam - ​​e pode até mesmo regular negativamente - a diferenciação osteogênica, como as células endoteliais 10. Em contraste, por exemplo, análises clonais de ASC mostram que apenas uma subpopulação são capazes de sofrer diferenciação in vitro osteogénico 11. Em última análise, os esforços de engenharia de tecidos esqueléticos provavelmente incorporar um células estaminais osteocompetent (tais como PSCs) com factores de crescimento exógenos e um andaime osteocondutor (tais como HA-PLGA utilizado nos presentes métodos) de modo a melhor curar defeitos do esqueleto.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

Células estaminais perivascular (PSC) pode ser isolado em números suficientes de tecidos múltiplas para fins de esquelético de engenharia de tecidos 1-3. CPPs são uma população FACS-classificada de &quot;pericitos&quot; (CD146 + CD34-CD45-) e de células adventícias &#39;(CD146-CD34 + CD45-), cada qual temos anteriormente relatados para ter propriedades de células-tronco mesenquimais. PSCs, como MSCs, são capazes de sofrer diferenciação osteogénico, bem como secretam pró-osteogénico 1,2 citocinas. No presente protocolo, demonstramos a osteogenicity de PSCs em diversos modelos animais, incluindo uma bolsa de implantação muscular em SCID (Severe Combined imunodeficientes) camundongos SCID, um rato de defeito ósseo craniano e um defeito femoral segmentar (FSD) em ratos atímicos. O modelo de bolsa muscular na coxa é utilizado para avaliar a formação óssea ectópica. Defeitos de calvárias estão centradas no osso parietal e são standardly 4 mm de diâmetro (tamanho crítico) 8. FSDs são bicortical e são estabilizados comuma barra de polietileno e K-fios 4. O FSD descrita é também um defeito de tamanho crítico, o que não significativamente curar a si própria 4. Em contraste, se as células estaminais ou factores de crescimento são adicionados ao local do defeito, a regeneração óssea significativa pode ser apreciada. O objectivo geral do xeno-enxerto PSC é demonstrar a capacidade osteogénico deste tipo de célula em modelos de regeneração tanto ectópicos e ortotópico ósseas.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de osso<em&gt; In vivo</em&gt;.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K visualizações.  School of Dentistry, UCLA. As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de osso In vivo.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Bioengenharia

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...