Esses métodos podem ajudar a responder às principais perguntas no campo dos biomateriais. Especialmente para a regeneração óssea. Eles são usados para avaliar a eficácia de biomateriais e potenciais respostas imunológicas.
A principal vantagem dessa plataforma multidisciplinar é que ela fornece uma gama de parâmetros para prever a biocompatibilidade de biomateriais utilizados para reparação óssea. As implicações dessas técnicas ósseas in vitro e in vivo se estendem para outras doenças ósseas. Devido à necessidade de triagem pré-clínica de novos biomateriais ortopédicos.
A metodologia dermatológica pode fornecer insights sobre biomateriais para a cicatrização óssea, também pode ser aplicada a avaliações biomateriais para qualquer outra indicação clínica. Média de cultura aspirada dos osteoblastos primários 14 dias após a adição do meio de mineralização osteogênica. Enxágüe duas vezes com 0,5 mililitros de 1X PBS.
Em seguida, fixar as células adicionando 0,5 mililitros de solução de formalina 10% tamponada e incubando à temperatura ambiente por 10 minutos. Após 10 minutos, aspire a formalina 10% tamponada com uma tubulação de uso único e lave duas vezes com 0,5 mililitros de água ultrapura. Em seguida, adicione 250 microliters de 40 mililitros solução de coloração Alizarin Red S aos osteoblastos fixos.
E incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos em um shaker a 100 shakes por minuto. Seguindo a incubação com solução de coloração, aspire a solução de coloração com uma tubulação de uso único e enxágue com um mililitro de água ultrapura. Repita esta etapa cinco a dez vezes até que a solução de lavagem saia clara para remover manchas não específicas.
Depois de aspirar a lavagem final, adicione um mililitro de PBS frio. E incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos em um shaker como antes. Em seguida, transfira os discos de fosfato beta tricálculo manchados para um novo poço e escaneie as placas com um scanner de localização para registrar a mineralização.
Após a captura da imagem, adicione 250 microliters de solução de cloreto de cetilítrio de 10% e agite por 15 minutos para extrair o corante Alizarin Red S. Em seguida, transfira a solução dos poços para tubos individuais de 1,5 mililitros e centrífuga a 17.000 x g por cinco minutos em temperatura ambiente. Diluir o extrato com solução de cloreto de cetilítrio de 10% a uma ração de diluição de 1:10 a 1:20 em um tubo de 1,5 mililitro.
Em seguida, transfira 300 microliters de cada amostra diluída para os poços da placa de 96 poços. Inclua dois poços em branco contendo apenas 10% de cloreto de cetilítrio. Em seguida, prepare sete padrões de referência Alizarin Red S que variam de 4 400 micromolar, diluindo a solução de coloração Alizarin Red S de 40 miliômlares com solução de cloreto de cetilítrio de 10% para gerar uma curva padrão.
Carregue 300 microliters de cada padrão na placa. Por fim, leia os absorventes das amostras, espaços em branco e padrões de referência em 520 nanômetros. Isole os precursores do osteoplasto da medula óssea dos fêmures e tíbias de um rato eutanizado usando uma tesoura estéril para remover as pernas do corpo na articulação do quadril.
Corte os membros nas articulações do joelho e tornozelo e remova o tecido mole com bisturi estéril e fórceps. Corte as epífitas. Insira uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa cheia com um mililitro de meio de crescimento ósseo no lúmen e jogue a medula em uma placa de Petri estéril de seis centímetros.
Depois de repetir isso para todos os fêmures e tíbias, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave a placa petri de seis centímetros com cinco mililitros de meio de crescimento ósseo e transfira-a para o mesmo tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 350 x g a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Após a centrifugação suspender as células em um mililitro por poço de meio de diferenciação osteoclasta. Um rato BALB/c fornece um número suficiente de precursores de osteoclato para uma placa de cultura de 24 poços. Adicione os osteoblastos primários suspensos no meio de crescimento ósseo no bioma material e nos controles a 8,8 * 10^4 células por centímetro quadrado.
Discos de fosfato de tricálcio beta, osso bovino controlado e plástico de cultura tecidual são usados aqui. Incubar a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após 24 horas, adicione precursores de osteoclatos de medula óssea recém-isolados e meio de diferenciação osteoclasta aos osteoblastos primários cultivados e retorne à incubadora por cinco dias de cultura a 37 graus celsius a 5% de dióxido de carbono.
Substitua o meio por meio de diferenciação osteoclasta recém-preparado a cada dois dias. Em seguida, colorir os osteoclatos para fosfattase ácida resistente ao tartarato para avaliar a diferenciação. Raspe o couro cabeludo de um rato BALB/c de oito semanas de idade anestesiado e limpe a superfície com solução de iodo povidone de 7,5% e 70% de etanol.
Cubra os olhos com pomada oftálmica para evitar a secagem durante o procedimento. Certifique-se de um nível adequado de anestesia por falta de reação a um dedo do dedo do sol e uma pitada de cauda. Em seguida, depois de fazer uma incisão sagital média remover os tecidos conjuntivos de paracranium acima do osso parietal direito raspando-o com um bisturi.
Em seguida, use uma trefina dentária estéril com um diâmetro de quatro milímetros a 2000 rotações por minuto para criar um defeito de tamanho crítico no osso parietal direito. Irrigar constantemente a região com solução salina estéril, ao mesmo tempo em que entedia o osso parietal direito e corta através do ectocortexto e algum endocórtex. Para evitar danos ao Dera Mater, use um pequeno elevador periosteal para quebrar o endocortex restante.
Em seguida, use fórceps para levantar cuidadosamente o osso calvarial e removê-lo. O defeito resultante deve ser circular e aproximadamente 3,5 milímetros de diâmetro. Em seguida, encha o defeito calvarial com espuma de colágeno de fosfato de tricálculo beta tricálculo, preso em PBS estéril.
Para manter o biomamaterial no lugar, aplique 0,5 microliters de adesivo tecidual no final do defeito em dois pontos opostos. Em seguida, feche a pele com uma sutura nãoabsorbável. Coloque um rato anestesiado nas costas, raspe a pele abdominal e limpe a superfície raspada com solução de iodo povidone de 7,5% e 70% de etanol.
Depois de fazer uma incisão média de oito milímetros através da pele ao longo da linha alba do abdômen, implante pbs bioma material encharcado sob a pele. Em seguida, suturar a pele com uma sutura nãoabsorbável. Oito semanas após a implantação, extirpa o local de implantação com tecido circundante do rato eutanizado.
Esta imagem demonstra que o crescimento em discos de fosfato beta tricálgio mostrados em barras abertas não afeta a viabilidade do osteoblasto em comparação com o crescimento na cultura tecidual plástico aos sete e 14 dias de cultura. Osteoblastos cultivados foram manchados com Alizarin Red S após 14 dias. A mineralização foi maior para controles médios de mineralização em comparação com os osteoblastos cultivados apenas em médios.
E em discos beta tricalcium fosfato em poços de cultura de suspensão. Quando um defeito calvário de tamanho crítico induzido cirurgicamente foi deixado vazio, uma camada fina cobrindo todo o defeito foi observada, mas nenhuma formação óssea significativa estava presente em 12 semanas após a operação. Em contraste, quando o defeito continha espuma de colágeno de fosfato de tricálcio beta, remanescentes de espuma cercados por tecido fibroso denso, incluindo alguns vasos sanguíneos e células inflamatórias, a ponte da área de defeito sem evidência de formação óssea.
Após a implantação da espuma de fosfato de fosfato beta tricálculo subcutâneo, observou-se uma resposta inflamatória com células gigantes do corpo estranho em seções de hematoxilina e eosina manchadas de uma evidência de fibrose nas seções manchadas de tricromático de Masson em oito semanas. Em contraste, o local de implantação dos controles falsos apresentava inflamação mínima e nenhuma fibrose. Ao tentar este procedimento é importante fazer um entalhe preciso e reprodutível do calvarium sem machucar o animal.
Seguindo outros métodos deste procedimento, como os ensaios de diferenciações osteoclasta e alta produtividade em modelos imunológicos peritoneal podem ser pré-formados a fim de responder a perguntas adicionais como a resposta do osteoclante a biomateriais e tipo de resposta imune.
