Este protocolo permite que os pesquisadores cultuem colônias de células-tronco em hidrogéis com controle completo sobre a rigidez do hidrogel e a geometria das colônias. A principal vantagem dessa técnica é que permite aos pesquisadores cultivar colônias de células-tronco em condições que melhor imitam o ambiente fisiológico do que o plástico da cultura tecidual. Ao executar este protocolo pela primeira vez, certifique-se de gerar um pouco mais de cada material e usar um ligante fluorescente para que você possa solucionar problemas e otimizar a cada etapa.
Esta técnica envolve múltiplas etapas que envolvem o posicionamento preciso de vários materiais. É muito mais fácil entender as instruções escritas para este protocolo uma vez que você vê-lo realizado. Para iniciar este procedimento, misture a base PDMS com o agente de cura PDMS a uma proporção de 10 para uma por peso e misture bem.
Desgas esta mistura em um dessecator por 30 a 60 minutos ou até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Despeje lentamente e uniformemente a mistura PDMS sobre a superfície do wafer preparado. Toque no prato na superfície de trabalho para liberar quaisquer bolhas de ar da superfície do wafer.
Asse o PDMS a 70 graus Celsius por duas horas e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, corte o PDMS em cerca de 10 por 10 milímetros quadrados, cada um contendo as características para uma única condição experimental. Estes serão chamados de selos para o restante do protocolo.
Depois disso, misture a base PDMS com o agente de cura PDMS a uma proporção de oito para um em peso, e misture bem. Desgas a mistura em um dessecador por 30 a 60 minutos ou até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Em seguida, despeje lentamente e uniformemente o PDMS em um prato limpo de 100 milímetros.
Toque no prato na superfície de trabalho para liberar quaisquer bolhas de ar. Asse o PDMS a 70 graus Celsius por duas horas e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Para cada selo gerado anteriormente, corte um quadrado de 15 por 15 milímetros de PDMS.
Estas serão referidas como lajes planas para o restante do protocolo. Inverta cada carimbo gerado em uma laje plana de PDMS de tal forma que as características no suporte para contato com uma laje plana de PDMS. Pressione suavemente na parte superior do selo com fórceps para garantir o contato uniforme.
Em seguida, coloque uma pequena gota de polímero UV-curável na interface superior de cada selo e par de lajes. O polímero será perverso entre os dois pela tensão superficial assistida pela gravidade. Coloque uma pequena gota do polímero UV-curável ao redor das bordas do selo e da interface da laje.
Isso cria uma fronteira que manterá a solução de ligante. Em seguida, coloque cuidadosamente o carimbo e coloque pares em uma caixa de esterilização UV. Use a configuração de alimentação STR estéril e exponha por 10 minutos.
Depois disso, remova os pares da caixa de esterilização UV e use dois pares de fórceps para remover suavemente o carimbo enquanto segura a laje plana e o estêncil que se formaram a partir do polímero UV-curável. Usando fórceps, remova cuidadosamente o estêncil e inverta-o de tal forma que a superfície que está em contato com a laje plana do PDMS esteja voltada para cima. Coloque os estêncil invertidos de volta na caixa de esterilização UV.
Use a configuração de alimentação STR estéril e exponha por três minutos. Usando fórceps, cuidadosamente colocado cada lado plano de estêncil para baixo em uma mancha de cobertura lavada com ácido certificando-se de que as características estão centradas no deslizamento da tampa. Coloque um pequeno pedaço de filme de laboratório em cima de cada estêncil.
Pressione firmemente e uniformemente o estêncil para criar um forte contato entre o estêncil e o deslizamento de tampas. Coloque os deslizamentos de cobertura com estêncil em um prato. Coloque este prato em um limpador de plasma e aplique plasma de alta potência por 30 segundos.
Em seguida, pipete a solução de ligante na superfície de cada estêncil. Para estêncil feito de 10 por 10 milímetros de selos quadrados, aplique 100 microliters por estêncil. Depois disso, enrole o prato contendo os deslizamentos de capa em filme de laboratório e incubar a quatro graus Celsius durante a noite.
Primeiro, lave a tampa com estêncil usando fórceps para submergir brevemente em um prato contendo PBS estéril. Submergir o deslizamento de tampas com estêncil em um segundo estágio de PBS para lavá-lo novamente. Remova o estêncil da superfície da mancha com cuidado para não quebrar a mancha de cobertura.
Em seguida, submerse brevemente o deslizamento de cobertura em um prato contendo água ultrauso para remover sais das lavagens PBS. Toque na borda da tampa para uma delicada limpeza de tarefas para afastar o excesso de água. Seque a tampa sob um gás inerte, como nitrogênio.
Em seguida, prepare uma solução de poliacrilamida para obter a elasticidade hidrogel desejada. Para cada deslizamento de cobertura padronizado, prepare um lábio inferior ativado por glutaraldeído com um espaçador colocado em cima. Pipeta entre 75 e 150 microliters de solução de poliacrilamida para o centro de cada deslizamento ativado por glutaraldeído.
Usando fórceps, coloque um padrão para cobrir o deslizamento em cada deslizamento de glutaraldeído com poliacrilamida e espaçador de tal forma que o ligante padronizado enfrente a solução de poliacrilamida. Coloque cuidadosamente cada sanduíche de poliacrilamida em um suporte de tampa com roscas compatíveis com tubos de fundo cônicos de 15 mililitros. Enrosque um tubo de fundo cônico de 15 mililitros em cada porta-tampa para segurar os sanduíches de poliacrilamida no lugar.
Centrifugar sanduíches de poliacrilamida nos tubos em baldes de balanço a 200 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Remova os tubos da centrífuga e coloque-os em racks de tubo para manter a orientação por mais 50 minutos para garantir a polimerização completa. Em seguida, retire os sanduíches dos tubos e submerse-os na PBS.
Enrole o prato em filme de laboratório e incubar à temperatura ambiente por três horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Depois disso, use um bisturi e fórceps para remover cuidadosamente o padrão para cobrir deslizamentos e o espaçador do sanduíche de poliacrilamida enquanto ele permanece submerso na PBS. Coloque cada mancha com poliacrilamida padronizada em um suporte de tampa.
Coloque a junta em cima da tampa e ao redor da poliacrilamida onde o espaçador estava localizado. Enrosque um tubo traseiro cônico de 15 milímetros no suporte da tampa, formando um poço com a poliacrilamida padronizada na parte inferior. Estes conjuntos se encaixam nos poços de uma placa padrão 12 bem para fácil manuseio.
Ao executar esta técnica, use um ligante fluorescente para garantir que o padrão desejado seja criado na superfície do deslizamento da tampa de vidro, e transferido com sucesso para a superfície do hidrágel de poliacrilamida durante a polimerização. A medida final do sucesso para este método é a capacidade de cultivar hESCs em geometrias desejadas nos hidrogéis padronizados. Quando cultivados como descrito no protocolo de texto, os hESCs normalmente proliferam para completar as geometrias padronizadas por 48 a 72 horas, uma vez que o Y27632 é completamente removido da mídia.
As colônias de culturing hESC em geometrias confinadas em hidrânicos de poliacrilamida permitem a medição de forças de tração geradas por células usando microscopia de força de tração. Essas medidas são feitas incorporando microesferas de fluorescência no hidrogel e imagens das posições dessas contas antes e depois da semeadura dos hESCs. As imagens das posições das contas podem ser usadas para gerar mapas de deslocamentos de contas que podem ser posteriormente usados para calcular as tensões de tração subjacentes.
Em colônias circulares de hESCs, as maiores tensões de tração são encontradas perto da borda periférica das colônias, enquanto o centro das colônias exibe tensões de tração uniformemente baixas. Apesar das distribuições não uniformes observadas de tensões de tração, os hESCs cultivados como círculos padronizados em condições de manutenção, exibem expressão uniforme do marcador de pluripotência De 3/4 e da molécula de adesão celular E-cadherin. Essa técnica permitirá aos pesquisadores modelar melhor embriões humanos usando células-tronco embrionárias humanas, levando a insights importantes sobre como os humanos se desenvolvem.
Este procedimento pode ser adaptado para qualquer aplicação em que um pesquisador visa cultivar células em geometrias definidas em hidrogéis macios. Este procedimento é compatível com a maioria dos ácidos bioquímicos, permitindo que os pesquisadores respondam a perguntas sobre como coisas como geometria tecidual e forças geradas por células afetam a expressão proteica e a sinalização celular. Muitos pesquisadores estão usando células-tronco embrionárias humanas para modelar o desenvolvimento humano precoce.
Essa técnica permitirá aos pesquisadores responder a essas questões importantes em condições que melhor imitam um ambiente fisiológico.
