1. Transfecção da célula hospedeira <ol><li> Semente de 2 x 10 6 células CHO-DXB11 no frasco de cultura de células T75 Corning em 15 ml meio de crescimento (MEMA com nucleotídeos e nucleosídeos (Gibco, número de catálogo 12571) suplementado com 10% γ irradiados caracterizada soro fetal bovino (cFBS) (HyClone, número de catálogo SH30071.03) e 10 mL / L de solução de glicose 45% (Sigma, número de catálogo G8769)) um dia antes de transfecção. </li><li> No momento da transfecção, preparar complexos de transfecção da seguinte forma: <ol class="lalpha"><li> Diluir 8 DNA mg em 800 mL de meio de crescimento sem soro em um tubo de microcentrífuga estéril. Misture delicadamente. </li><li> Diluir 40 mL Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) em 800 mL de meio de crescimento sem soro em um tubo de poliestireno. </li><li> Adicione o DNA diluído para o ™ Lipofectamine diluída. Misture delicadamente e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Remova o meio de crescimento de células em T75 e substituir, com 6,4 ml de meio de crescimento sem soro. Adicione o ml 1,6 de complexos de transfecção ao balão. Misture delicadamente balançando a placa. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 por 6 horas. </li><li> Adicionar 8 ml de meio de crescimento para o balão e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> Remova o meio de aspiração e adicione meio de crescimento frescas para o balão. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> Substituir o meio de crescimento com meio de seleção (MEMA meio sem nucleotídeos ou nucleosídeos (Gibco, número de catálogo 12561) suplementado com 10% γ irradiados soro fetal bovino dialisado (DFBS) (HyClone, número de catálogo SH30079.03) e 10 mL / L 45 solução de glucose% (Sigma, código G8769)). </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 por 2-3 semanas. </li></ol> 2. Clonagem por separação de células Fluxo Citometria Activated <ol><li> Desalojar as células do frasco e centrifugar a 800 rpm por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em meio de seleção suplementado com 2% de albumina sérica bovina e fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano na diluição de 1:20. </li><li> Incubar no gelo por 15-30 minutos e depois lave duas vezes com PBS frio. Ressuspender as células em 1x PBS em um tubo de polipropileno. </li><li> Prepare-se para classificar asséptica em um FACSAria BD ™. Prepare de 96 poços da placa de cultura de células que contém 200 mL meio de seleção em cada poço. </li><li> Assepticamente carregar o tubo com as células e analisar em BD FACSAria ™, registrar os resultados para as células manchadas e sem manchas, respectivamente. </li><li> Definir as portas e as configurações para classificar uma única célula do perfil desejado de fluorescência de coloração em 96 poços da placa (s). <ol class="lalpha"><li> Células transfectadas são primeiramente analisados ​​com base na dispersão frontal versus dispersão lateral. Um portão de células vivas é feita com base na dispersão para a frente, que mede o tamanho de uma célula, e dispersão lateral, que mede a complexidade de uma célula ou granularidade. </li><li> As células que se enquadram nesta portão são então analisados ​​para a coloração de PE. PE portão negativo é definido para unstained células transfectadas ou células hospedeiras manchado. Como as células marcadas transfectadas são examinados pelo FACS, o &quot;High PE&quot; gate é então delineada para abranger o top 5% de todas as células que são positivos para a coloração de PE. </li></ol></li><li> Incubar as placas em 37 ° C incubadora por duas semanas. </li></ol> 3. Documentação de formação de colônia por CloneSelect ™ Imager Formação de documento colônia em placas de 96 poços na CloneSelect Imager ™ no dia 0, dia 3, dia 7 e dia 13 após FACS classificação. A documentação imagem vai garantir a selecção de clones derivados de uma única célula. Um passo fundamental nesta documentação está recebendo o plano focal ajustados corretamente para a medição dia 0, uma vez que existe apenas uma célula em cada poço a esse ponto. É muito importante que as imagens dessas células individuais estão em foco e tentar ajustar o foco sobre eles pode ser enganosa na melhor das hipóteses. O plano focal pode variar significativamente entre as marcas de placas e possivelmente até mesmo de lote para lote da mesma marca. Assim, um plano pré-determinado focal precisa ser usado. Isso pode ser feito concentrando-se em teste de micro-grânulos ou células de alta densidade depositados em placas do mesmo lote a ser utilizado. Alternativamente, as placas totalmente crescido a partir do mesmo lote pode ser utilizado para este fim. Depois FACS classificação, também é importante para permitir que as células se contentar com um mínimo de 2 horas antes da imagem, de modo que eles serão &quot;fixo&quot; na posição na chapa. 4. Triagem e seleção de clones altamente produtivos <ol><li> Posição documento de amostra no recebimento placas de 96 poços ensaio. </li><li> Alíquotas transferência de 20 mL sobrenadante (diluir, se necessário) em placas de 96 poços de ensaio pela Liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. Este robô flexível e capazplataforma IC foi adaptado para este trabalho e outra cultura automatizada de células. Programas especiais foram escritos para melhor utilizar e melhorar as capacidades Freedom EVO robótica para o desenvolvimento de linhagem celular. Um exemplo disso é a criação do TECAN para interpretar dados CloneSelect Imager ™ para amostragem de poços com colônias único. Outros programas foram necessários para executar tarefas adicionais de células da cultura, como fazer as diluições apropriadas das amostras colhidas, de interpretar, catálogo e placas de amostra manualmente marcados, se necessário, para aumentar os clones de alta produção, etc Muitos destes programas pode ser facilmente aplicado a 384 placas bem como bem como o formato de 96 poço original. </li><li> Produção de anticorpos nas amostras é analisada por um sanduíche de IgG humana detecção de ELISA (Pierce, Rockford, IL) sobre a liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. <ol><li> Amostras e standard (Human mieloma IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) foram carregados em pré-revestidas Bio Brasão anti-humano IgG Placas Assay (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> As placas foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas seguido de três lavagens PBS. </li><li> ImmunoPure Goat Anti-IgG humana (Fc-gama)-HRP (Pierce, Rockford, IL) foi adicionado à placa na diluição de 1:2000 e incubados por uma hora em temperatura ambiente. </li><li> As placas foram lavadas três vezes com PBS antes de adicionar ABTS substrato (Pierce, Rockford, IL) e foram lidas em um leitor de placas utilizando absorvância a 405 nm para a detecção. </li></ol></li><li> Selecionar clones altamente produtivos e avaliar a produtividade na cultura de suspensão. Para fed-batch cultura, as células foram inoculadas em 0.3X106 células / mL em meio livre de proteína ADVANTAGE JRH IMEDIATA 65.578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS), suplementado com 5 g / L de soja hidrolisado (DMV International, número de catálogo SE50MAF-UF muito, número) e incubados a 37 ° C com 7,5% de CO 2. A cultura continuou e foram suplementados com 2 g / L de glicose (Sigma, código G8769, número de lote 098K2329) quando glicose mais concentração de lactato na cultura chegou abaixo de 2 g / L, e 2 alimentados mM de glutamina (Gibco, número de catálogo 25030, número do lote 568177), quando os níveis de glutamina chegou abaixo de 200 mg / L (metabólitos medidos por YSI Bioanalyzer). Fed-batch culturas foram encerradas no dia 14 ea produção de anticorpos foi medida por HPLC fase reversa. </li><li> Caracterização genética de clones candidato por hibridização fluorescente in situ (FISH) 5. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de desenvolvimento de anticorpos produzir clones com o método de alto rendimento é mostrado na Figura 1 e Figura 2. Pool de células transfectadas foi corado com fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano (Figura 1A), analisados ​​e classificados em BD FACSAria ™ (Figura 1B). Formação de colônias em placa de 96 poços foi fotografada em CloneSelect Imager ™ (Figura 1C). Sobrenadante de cultura de células foi amostrado de poços que contêm única colônia e analisados ​​por ELISA no EVO Liberdade TECAN ® sistema de manipulação de líquidos (Figura 1D). Clones altamente produtivos foram encontrados a partir de células que apresentaram maior nível de anticorpo de superfície refletida pela coloração fluorescente com anticorpo anti-IgG humana. Quando se comparam clones gerados a partir de duas populações do pool de células transfectadas inicial, uma grande diferença na produtividade em cultura em batelada alimentada foi observada (Figura 2). Para os dois primeiros clones gerados a partir da população de células com alta expressão de superfície de anticorpos (PE alta), a produtividade específica variou 50-70 pg / célula / dia. Considerando que a produtividade de anticorpos foi de ~ 20 pg / célula / dia para os dois clones gerados a partir da população de células com baixa expressão de superfície de anticorpos (PE baixo). Além disso, linhagens de células desenvolvidas pela classificação FACS são mais estáveis ​​em relação à produção de anticorpos do que aqueles que foram clonados por diluição calagem manual (Figura 3A). A produtividade específica do clone de topo, &quot;Clone 1&quot;, gerado por diluição manual de calagem caiu de ~ 30 para ~ 10 pcd pcd após o cultivo de 80 duplicações celulares. Por outro lado, a top subclone gerados por FACS classificação, &quot;Clone 2&quot;, foi capaz de manter a produtividade específica em torno de 20 pcd para pelo menos 100 duplicações celulares. Por hibridização fluorescente in situ (FISH), demonstramos Clone 1 mostrou como uma população mista de fenótipo A (85%) e fenótipo B (15%). Em contraste, FACS classificadas clone (clone 2) mostrou-se uma população mais homogênea, com 99,5% das células mostrou-se fenótipo A. (Figura 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Desenvolvimento de linhas de produção de células para a produção de anticorpos monoclonais a partir de células CHO. A) coloração da superfície da piscina célula inicial transfectadas com fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano. B) A classificação da população de células com alta intensidade de fluorescência (PE de alta) e baixa intensidade de fluorescência (PE baixo) em placa de 96 poços. C) Documentar colôniaformação desde o primeiro dia pós-semeadura de 0 a 13 dias em CloneSelect Imager ™. D) Screening clones por ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Superfície nível de anticorpos associados se correlaciona com a produtividade de anticorpos da célula. Clones com alta e baixa coloração fluorescente foram desenvolvidos em linhas celulares e avaliados em cultura em batelada alimentada. Volumétrica título e produtividade foram comparadas entre os top 2 clones de cada população. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Clones gerados a partir de FACS classificação exibem maior homogeneidade genética e estabilidade clone. A) a estabilidade da produção de anticorpos em cultura de lote para ~ 80 duplicações celulares de tempo decorrido cultura. Δ, clone foi gerada através da diluição limitante, onde as células foram semeadas em 2000 células / poço, 1000 células / poço e 500 células / poço. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triângulo preto" /> , Clone foi gerada através de FACS em 1 célula / poço. B) Transgene sítio de integração no cromossomo CHO célula é identificada por hibridização fluorescente in situ.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Os autores deste artigo são funcionários da Inc., Merck &amp; Co., que utilizam este método para a produção em larga escala de proteínas terapêuticas a partir de linhas de células de mamíferos.

Nós apresentamos um sistema automatizado de fabricação de células plataforma de desenvolvimento de linha que permite o isolamento de clones altamente produtivos, e na média, enquanto garante clonalidade e estabilidade clone. A contratação de coloração anticorpo de superfície seguido por separação de células FACSAria ™ é a chave para a obtenção de clones único com produtividade elevados de anticorpos. Nossos resultados e outros relatórios 2-4 sugerem que o nível de anticorpos transitoriamente exibido na superfície da célula bem correlacionados com a produtividade da célula. Assim, um anticorpo conjugado com fluoresceína pode ser usada para reconhecer o produto membrana associados e ajuda o isolamento de grandes produtores. Alternativamente, co-expressão de genes repórter e tecnologia microdrop gel têm sido usados ​​para facilitar a seleção de clones de alta produção por FACS 6-8. Além de isolar clones de alta produção via FACS, outras tecnologias têm evoluído para atingir o mesmo objetivo. Estes incluem Trellis tecnologia CellSpot Bioscience que usa sistemas de detecção de anticorpos microspere e tecnologia a laser de triagem para identificar clones altamente produtivos e eliminar células indesejáveis, Genetix ClonePix FL e StemCell Technologies ClonaCell plataforma EasyPick que realizar a triagem de alto rendimento de linhas de produção de células usando um sistema de detecção de anticorpo fluorescente . Optamos por implementar o método de clonagem FACS com base na superfície nível de anticorpos associados, porque combina a facilidade de operação, a seletividade na produtividade e clonalidade. O emprego de TECAN EVO ® Freedom sistema de manipulação de líquidos aumentaram significativamente throughput screening, que oferecem a oportunidade de selecionar clones de alto rendimento a partir de um pool de células muito maiores. Outros instrumentos para o ensaio, como HTRF, BioForte Octet, HPLC, etc, são todos os meios possíveis de selecionar os produtores de alta e triagem para produtores de baixa. Acompanhando a formação de clone com CloneSelect Imager ™, geramos documentação necessária para provar clonalidade com a história digitalizados linha celular. Clonalidade é ainda confirmada por caracterizar geneticamente único sítio de integração do transgene no cromossomo. Um passo subclonagem, que normalmente é tomado para assegurar clonalidade, pode assim ser eliminado. Isso vai poupar 4-8 semanas de tempo para o desenvolvimento de linhagem celular. Em resumo, as linhas de células de qualidade gerados pela plataforma de alto rendimento automatizada mostrou alta produtividade, estabilidade de produção e história documentada linha de células que devem atender à demanda de produção em larga escala e atuais exigências regulamentares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Sorter celular </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema de manuseio de líquidos </td><td> Tecan Grupo </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

A indústria biofarmacêutica rápido crescimento demandas rápido desenvolvimento de sistemas de produção altamente eficiente e confiável para atender a necessidade crescente de fornecimento de medicamentos. A geração de linhagens de células de produção tradicionalmente envolvidos operações manuais que são de trabalho intensivo e de baixo rendimento e vulnerável a erros humanos. Nós relatamos aqui uma plataforma integrada de alto rendimento e automatizados para o desenvolvimento de linhas de fabricação de células para a produção de proteínas terapêuticas. A combinação de BD FACS Aria ™ Sorter Cell, CloneSelect ™ Imager e TECAN Freedom EVO ® sistema de manipulação de líquidos, permitiu um alto rendimento e mais eficiente processo de desenvolvimento de células de linha. Nesta operação, células hospedeiras de produção são os primeiros transfectadas com um vetor de expressão com o gene de interesse 1, seguido pelo tratamento com um agente de seleção. As células estavelmente transfectadas são então marcadas com fluorescência rotulados de anticorpos IgG anti-humanos, e são posteriormente sujeitas a análise de citometria de fluxo 2-4. Células altamente produtivas são selecionados com base na intensidade de fluorescência e são isoladas por uma única célula de classificação em um FACSAria BD ™. Formação de colônias a partir de uma única célula estágio foi detectada ao microscópio e uma série de imagens em tempo-voltas digitais são tomadas por CloneSelect ™ Imager para a documentação da história da linhagem celular. Depois de clones único formaram, estes clones foram selecionados para a produtividade por ELISA realizado em Liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. Aproximadamente 2.000 - 10.000 clones podem ser rastreados por ciclo de operação com a configuração atual do sistema. Esta abordagem integrada tem sido utilizada para gerar alta produção ovário de hamster chinês linhas (CHO) de células para a produção de anticorpos monoclonais terapêuticos (mAb), bem como suas proteínas de fusão. Com a ajuda de diferentes tipos de sondas de detecção, o método pode ser usado para o desenvolvimento de terapias protéicas outros ou ser aplicada a sistemas outro host de produção. Comparando com o procedimento manual tradicional, esta plataforma automatizada demonstrado vantagens da capacidade significativamente aumentada, clonalidade assegurada, rastreabilidade na história linha celular com documentação eletrônica e oportunidade muito reduzida no erro do operador.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K visualizações.  Merck & Co., Inc. A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Medicina

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

O Uso de cistometria em pequenos roedores: Um Estudo de Chemosensation Bexiga

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

A administração intranasal de Terapêutica do SNC para Ratos Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo resposta ao tratamento de tumores primários e / ou Associated Metástases para pré-clínica e clínica de Desenvolvimento Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Análise de alto throughput de dados de mapeamento óptico usando o ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...