Os autores gostariam de agradecer ao HealthPartners Animal Care Institucional e Comitê de Uso do Hospital Regiões.

1. Aclimatação a manipulação para administração intranasal de Ratos Awake Introdução Mice devem ser aclimatados a manipulação por um período de 2-4 semanas antes do início da administração intranasal. Aclimatação a manipulação é importante, pois ajuda a garantir uma posição correta do corpo para a eficácia máxima de entrega de drogas acordado intranasal. Além disso, os ratos que não tenham sido adequadamente acostumados a esse processo pode ter uma reacção grave ansiedade após a administração. Mice deve passar de cerca de 2-3 dias em cada uma das nove passos antes de avançar para o passo seguinte, dependendo de conforto do animal para o manuseamento. O nível de tensão do rato deverá ser utilizado como uma medida do progresso. Isso significa controlar os movimentos do mouse, a quantidade / freqüência de defecação, micção, tremendo, e morder. Se um mouse tem uma resposta de estresse elevado, permanecer nessa etapa antes de avançar para o próximo até que a resposta é reduzido. Uma amostra de aclimatação schedule pode ser visto na Tabela 1. Aclimatação dos ratinhos devem progredir através dos seguintes de uma vez por dia etapas. Executar estes passos mais do que uma vez por dia, em uma tentativa de acelerar a adaptação, não é recomendado. <ol><li> Colocar o rato na palma da mão durante um período de dois a três minutos, não mais do que um pé acima da parte superior da gaiola, os animais frequentemente saltar durante este passo de introdução. Se o rato tenta rastejar para fora da mão e até um braço, basta levantar o mouse pela base da cauda e colocá-lo de volta na mão. </li><li> Posicione o mouse na palma da mão por três minutos e pet o animal delicadamente. Pet o mouse direcional da cabeça à cauda, ​​enquanto permite que o animal se movimentar livremente. </li><li> Colocar o rato na palma da mão durante três minutos enquanto massageia atrás das orelhas (levemente beliscar juntos a pele na parte de trás do pescoço, utilizando o polegar e o dedo indicador). </li><li> Segure / lipé o mouse pela nuca de seu pescoço por 30 segundos, deixando o resto do mouse no topo de gaiola por 30 segundos antes de repetir o porão novamente. </li><li> Segure o mouse usando a alça intranasal, que é descrito na seção 2, mas não inverter o animal (completar até o passo 2.4). Segure o animal como este por um período de 30 segundos e solte volta para o topo da gaiola. Repita uma segunda vez, após um período de descanso de um minuto. </li><li> Segure o mouse com o aperto intranasal como descrito na seção 2, incluindo o animal invertendo assim o seu lado ventral é voltado para cima em direção ao teto. Certifique-se de que o pescoço do animal é paralelo ao chão. Mantenha essa posição por 30 segundos. Repita esta uma segunda vez, após um período de descanso de um minuto. Alguns ratos irá resistir a aderência intranasal mais do que os outros, especialmente quando usado pela primeira vez, com inversão no passo na aclimatação. Se o rato se livra das garras, coloque o mouse de volta no topo de gaiola e re-aperto. Repita o re-aperto, se necessário, Mas monitorar o nível de estresse do mouse e devolvê-lo para a jaula, se necessário. Outro factor que pode desempenhar um papel na perda da aderência, neste ponto do processo de aclimatação é inexperiência dos tratadores de animais com a técnica de entrega intranasal. </li><li> Segure o mouse com o aperto intranasal, inverter, momentaneamente colocar uma pipeta com uma ponta de vazio em cada narina, e mantenha a posição por 30 segundos animais. Repita este depois de um período de descanso de um minuto. </li><li> Segure o mouse com o aperto intranasal, invertê-lo, e por via intranasal administrar 6 ul de solução salina no nare esquerda e direita, como descrito na seção 3 (até a etapa 3.7). </li><li> Segurar o rato com o aperto intranasal, invertê-lo, e intranasal administrar 6 ul de solução salina no nare esquerda e para a direita duas vezes colocando o animal de volta no topo de gaiola no meio, como descrito na secção 3. </li></ol> 2. O Punho intranasal para imobilizar Ratos Awake <ol><li> Coloque o rato on superior da gaiola. </li><li> Com o polegar eo dedo indicador de sua mão dominante, segure o mouse pela cauda. Usando o seu meio, anel, e os dedos mindinho, levemente fixar a porção inferior do corpo para o topo da gaiola (Figura 1A). Vamos pegar o mouse sobre as barras que você levemente esticar o mouse para fora e melhor pegar a nuca. </li><li> Usando o polegar eo dedo médio da sua mão não-dominante, aperte o mouse firmemente na nuca (excesso de pele) por trás do pescoço e ombros. Puxe a pele frouxa para fazer uma tenda de pele entre as omoplatas (Figura 1B). Tire a pele tanto quanto possível, mas tenha cuidado para não puxar o músculo como isso irá causar desconforto para o mouse. Tenha cuidado para não aplicar muita pressão para caixa torácica do animal ou da coluna vertebral. A pressão excessiva ou puxar da pele pode conduzir à inibição da respiração, em alguns casos. </li><li> Rapidamente coloque o dedo indicador de sua mão não-dominante na cabeça do rato comoperto do nariz quanto possível e puxe a pele (Figura 1C, 1D). Ao mesmo tempo, deslize o polegar e os dedos médios em direção à cabeça para a posição ideal. Idealmente, o rato não deve ser capaz de mover a sua cabeça na vertical ou na horizontal. </li><li> Apesar de manter o controle sobre a nuca, vire o mouse sobre as costas. Trás do rato deve estar na palma da sua mão. Segure firmemente a cauda do rato (perto da base) contra a palma da mão com os últimos dois dedos (anel e mindinho) para estabilizar o mouse, ou você pode envolver seus dedos pela parte inferior do corpo (Figura 1E, 1F). </li><li> Neste ponto, certifique-se de que o pescoço do rato e do queixo são planos e paralelos ao chão. O queixo deve ser próximo de um ângulo de 180 graus, com o gargalo, tanto quanto possível, para ajudar com a administração intranasal. Pequenas alterações na inclinação, pode fazer com que o medicamento para acabar no sítio errado. Verifique se o mouse é capaz de respirar por assistir o abdômen. O sho do mouseuld não ser capaz de se mover, mas deve ser confortável e não em qualquer dor. Se você ver o pescoço do rato e do queixo fazendo um &quot;V&quot;, então você precisa re-aperto. </li></ol> 3. Entrega intranasal de Drogas para Ratos Awake Introdução Usando o aperto intranasal, cada rato é restringida por duas vezes e mantido com o seu pescoço paralelo ao chão enquanto um volume de 20-30 uL de líquido é administrado. Este volume é seguro e eficaz para os pequenos-grandes ratos, nós normalmente usam 24 ul, e que é descrito neste protocolo. O método acordado intranasal podem ser utilizados em ratinhos de todas as idades, por exemplo, em ratos recém-nascidos para a pesquisa de desenvolvimento neuroscience. Em ratos recém-nascidos, um menor volume total (8 uL) e o tamanho das gotas (1 ul) deve ser utilizado para acomodar o menor volume da cavidade nasal. Droga é normalmente entregue a dois ratos de cada vez, alternando os períodos de repouso para permitir a utilização mais eficaz do tempo e manter ocronograma de n. Set-up vai ser um pouco diferente dependendo se você estiver dosagem ratos alojados em grupo ou ratos alojados individualmente. Com os ratos alojados individualmente, é útil para colocar todos os seus materiais entre as gaiolas para evitar que ratos de cruzar para o topo outra gaiola. Com o grupo de ratos alojados dose, desde que somente gaiola. É importante que cada rato numa gaiola alojados em grupo recebe o mesmo tratamento intranasal, como o potencial de contaminação cruzada de dois tratamentos diferentes existe devido à expulsão de drogas para o ar ou com o contacto com a pele. É altamente recomendável que uma folha de dosagem ser impresso com antecedência, para lembrar os técnicos de trabalhos de tratamento, para registrar todas as notas de gotas perdidas, a nota geral de saúde de cada animal, etc Passos <ol><li> Configure jaulas onde eles deveriam estar para a dosagem, e montou uma estação de dosagem (Figura 2). </li><li> Retire do mouse de gaiola e manter em cima da gaiola durante a dosagem. </li><li> Pegue o mouse usando o aperto intranasal descrito na seção 2. </li><li> Usando sua mão dominante, carregar o pipetador com 6 ul de droga ou veículo. Colocar a ponta da pipeta a cheio perto narina esquerda do rato, geralmente a um ângulo de 45 graus (Figura 1G, 1H). Se você tiver uma solução viscosa que você pode precisar de aumentar o seu ângulo de 90 graus, porque a droga pode correr até o lado da ponta da pipeta em vez de fazer uma gota. Se muito viscoso, limpando a ponta da pipeta com um lenço antes de expelir líquido pode ajudar. Lentamente ejectar a droga para formar uma pequena gota com cerca de metade do volume (3 ul). </li><li> A gotícula deve ser colocado suficientemente perto narina do rato de modo que o rato pode inalar a gota. Imediatamente após o rato inala esta pequena gota, ejectar o resto do medicamento na ponta da pipeta de modo a formar uma outra gotícula pequeno para o rato a inalar através da narina mesmo cerca de 2-3 segundos depois. Não deixe de ver a boca. Se há is qualquer líquido na boca, a queda não torná-lo totalmente no nariz e isso deve ser observado. </li><li> Segure o mouse nesta posição por 15 segundos. É altamente recomendável que um temporizador ser usado para padronizar esta espera 15 seg. </li><li> Repita os passos de 3,3-3,6 para a narina direita. Se as gotas são bufou fora, que a queda deve ser substituído e anotados. </li><li> Posicione o mouse de volta ao topo de sua gaiola por 2 min. Repita o processo inteiro a partir de 2 min. após a entrega da primeira queda. Isto dá o rato quatro gotas de 6 ul de cada, totalizando 24 jul de solução. Uma programação de dosagem de amostra para um ou dois ratos de uma só vez pode ser visto na Tabela 2. </li><li> Depois de o rato recebeu todas as gotas, devolva o mouse para sua gaiola. </li></ol> 4. Técnicas de Manuseio de animais gerais para Aclimatação e administração intranasal de droga para Ratos Awake Após cada sessão de aclimatação ou administração intranasal, os murganhos devem darnd tratar, tal como uma Cheerio ou semente de girassol descascada, como reforço positivo. Guloseimas são dadas como recompensa e para distraí-los de coçar o nariz, que pode causar ferimentos a si mesmos. Ao trabalhar com ratos alojados em grupo, trata suficientes devem ser descartados para cada rato. Antes de regressar às suas gaiolas animais não deixe de restaurar ninhos para os seus estados originais, a fim de reduzir o stress. No doseamento de animais alojados em grupo, as luvas devem ser mudadas entre a dosagem de gaiolas de modo a não transferir aroma de colónia para colónia gaiola gaiola, uma vez que irá tornar-se agressivo para o outro.

<ol>
	<li>Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system:+mechanisms+and+experimental+considerations.">Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations.</a> J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).</li><li>Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+insulin-like+growth+factor-I+to+the+rat+brain+and+spinal+cord+along+olfactory+and+trigeminal+pathways+following+intranasal+administration.">Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration.</a> Neuroscience. , 127-481 (2004).</li><li>Benedict, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+insulin+as+a+therapeutic+option+in+the+treatment+of+cognitive+impairments.">Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments.</a> Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).</li><li>Francis, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+insulin+prevents+cognitive+decline,+cerebral+atrophy+and+white+matter+changes+in+murine+type+I+diabetic+encephalopathy.">Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy.</a> Brain. 131, 3311-3334 (2008).</li><li>Francis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+insulin+ameliorates+experimental+diabetic+neuropathy.">Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy.</a> Diabetes. 58, 934-945 (2009).</li><li>Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awake+intranasal+insulin+delivery+modifies+protein+complexes+and+alters+memory,+anxiety,+and+olfactory+behaviors.">Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors.</a> J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).</li><li>Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+deferoxamine+reduces+spatial+memory+loss+in+APP/PS1+mice.">Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice.</a> Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+intranasal+losartan+in+the+APP/PS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease.">Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease.</a> Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).</li><li>Fine, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+deferoxamine+improves+performance+in+radial+arm+water+maze,+stabilizes+HIF-1alpha,+and+phosphorylates+GSK3beta+in+P301L+tau+transgenic+mice.">Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice.</a> Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).</li><li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system.">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).</li><li>Hanson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+deferoxamine+provides+increased+brain+exposure+and+significant+protection+in+rat+ischemic+stroke.">Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke.</a> J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).</li><li>Reger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intranasal+insulin+on+cognition+in+memory-impaired+older+adults:+modulation+by+APOE+genotype.">Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype.</a> Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).</li><li>Kim, C. H., Song, H. y. u. n., M, E. u. n. A. h. n., Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypo-,+iso-+and+hypertonic+saline+irrigation+on+secretory+mucins+and+morphology+of+cultured+human+nasal+epithelial+cells.">Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells.</a> Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).</li><li>Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+increases+secretory+and+exudative+responsiveness+of+human+nasal+airway+in+vivo.">Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo.</a> Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este método mostra como os ratos podem ser administradas doses regulares de droga intranasal para atingir o cérebro sem o uso de anestesia. Droga intranasal podem ser entregues para grandes grupos de ratinhos durante longos períodos de tempo com um mínimo de esforço. Um grupo único de até 20 ratinhos por via intranasal podem ser tratados por uma única pessoa, em menos de uma hora. Uma ampla variedade de moléculas, desde pequenas quelantes de ferro para os factores de crescimento para as células estaminais mese...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Materials</td>
 <td>Company</td>
 <td>Cat #</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P20 pipettor set at 6 &mu;l</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading pipette tips</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waste receptacle for tips</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dosing sheet for notes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drug and vehicle</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Container to hold drug vials</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animals to be dosed</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spare gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paper towels to wipe urine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Materials Needed</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

intranasal administration of cns therapeutics to awake mice

A administração intranasal é um método de administração de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC). É não-invasiva e permite que as moléculas grandes que não atravessam o acesso barreira sangue-cérebro para o SNC. Drogas são diretamente direcionados para o SNC com a administração intranasal, reduzindo a exposição sistêmica e, portanto, indesejáveis ​​efeitos colaterais sistêmicos 1. Entrega do nariz para o SNC ocorre dentro de minutos ao longo de ambas as vias olfativas e trigeminais neurais através de uma via extracelular e não necessita de fármaco para se ligar a qualquer receptor ou o transporte axonal 2. A administração intranasal é um método amplamente divulgado e está sendo usado em testes clínicos em humanos 3. A administração intranasal de drogas em modelos animais permite a avaliação inicial de distribuição farmacocinética e eficácia. Com ratos, é possível a administração de drogas para animais acordados (não-anestesiados) numa base regular usando uma especializaçãozou aderência intranasal. Entrega acordado é benéfico, pois permite que a longo prazo a administração crónica sem anestesia, leva menos tempo do que com a anestesia, e pode ser aprendido e feito por muitas pessoas para que as equipes de técnicos números podem grande dose de camundongos em períodos curtos. A eficácia de terapêuticas administradas por via intranasal, desta forma a ratinhos tem sido demonstrada em vários estudos, incluindo insulina em modelos de ratos diabéticos 4-6 e deferoxamina em modelos de ratinho de Alzheimer 7,8. O aperto intranasal para ratos pode ser aprendido, mas não é fácil e requer prática, habilidade e um aperto preciso de efetivamente entregar drogas para o cérebro e evitar a drenagem para o pulmão e o estômago. Os ratinhos são restringidos à mão usando um scruff modificado na mão não-dominante com o gargalo realizada paralela ao chão, enquanto medicamento é fornecida com uma pipeta utilizando a mão dominante. Ele normalmente leva 3-4 semanas de aclimatação antes de lidar com ratospode ser realizada com este aperto sem uma resposta ao estresse. Nós preparamos este vídeo JoVE para fazer esta técnica administração intranasal mais acessível.

Existem várias formas de determinar a eficácia de entrega de drogas. O primeiro é para administrar por via intranasal uma tinta, tais como tinta ou India azul de metileno e de visualizar o corante após eutanásia do animal dentro do epitélio olfactivo e depois o cérebro é retirado, entrar no SNC através da placa cribiforme. A segunda é a de medir a droga administrada quer através de uma etiqueta de rádio-marcado ou através de ELISA de detecção da molécula não etiquetada. Um bom exemplo de distribuição ...

Watch this Scientific Journal Video about Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice at JoVE.com

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Um método para administrar medicamentos por via intranasal aos ratinhos acordado para o objectivo de atingir o cérebro é descrito. Este método permite doses repetidas durante longos períodos, utilizando a administração intranasal de droga sem anestesia, e nariz ao cérebro de entrega com a exposição sistémica mínima.

A administração intranasal de Terapêutica do SNC para Ratos Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

intranasal-administration-of-cns-therapeutics-to-awake-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

58.1K visualizações.  HealthPartners Institute for Education and Research. Um método para administrar medicamentos por via intranasal aos ratinhos acordado para o objectivo de atingir o cérebro é descrito. Este método permite doses repetidas durante longos períodos, utilizando a administração intranasal de droga sem anestesia, e nariz ao cérebro de entrega com a exposição sistémica mínima.

Vídeo: Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Medicina

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

A Rat carótida Balão Injury modelo para testar Therapeutics remodela Anti-vasculares

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing factor in the overall outcome. Immunoblotting, flow cytometry and fixed cell experiments are often used to study how cells respond to anti-cancer drugs. These methods are important, but they have several shortcomings. Variability in drug responses between cancer and normal cells, and between cells of different cancer origin, and transient and rare responses are difficult to understand using population averaging assays and without being able to directly track and analyze them longitudinally. The microscope is particularly well suited to image live cells. Advancements in technology enable us to routinely image cells at a resolution that enables not only cell tracking, but also the observation of a variety of cellular responses. We describe an approach in detail that allows for the continuous time-lapse imaging of cells during the drug response for essentially as long as desired, typically up to 96 hr. Using variations of the approach, cells can be monitored for weeks. With the employment of genetically encoded fluorescent biosensors numerous processes, pathways and responses can be followed. We show examples that include tracking and quantification of cell growth and cell cycle progression, chromosome dynamics, DNA damage, and cell death. We also discuss variations of the technique and its flexibility, and highlight some common pitfalls.

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Novel Methods for Intranasal Administration Under Inhalation Anesthesia to Evaluate Nose-to-Brain Drug Delivery

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain barrier. However, there have been few reports regarding not only the quantitative analysis but also optimal administration conditions and dosing regimens for investigations of nose-to-brain delivery. The limited progress in research on nose-to-brain pathway mechanisms using rodents represents a significant impediment in terms of designing nose-to-brain delivery systems for candidate drugs.
To gain some headway in this regard, we developed and evaluated two novel methods of stable intranasal administration under inhalation anesthesia for experimental animals. We also describe a method for the evaluation of drug distribution levels in the brain via the nose-to-brain pathway using radio-labeled [14C]-inulin (molecular weight: 5,000) as a model substrate of water-soluble macromolecules.
Initially, we developed a pipette-based intranasal administration protocol using temporarily openable masks, which enabled us to perform reliable administration to animals under stable anesthesia. Using this system, [14C]-inulin could be delivered to the brain with little experimental error.
We subsequently developed an intranasal administration protocol entailing reverse cannulation from the airway side through the esophagus, which was developed to minimize the effects of mucociliary clearance (MC). This technique led to significantly higher levels of [14C]-inulin, which was quantitatively detected in the olfactory bulb, cerebrum, and medulla oblongata, than the pipette method. This appears to be because retention of the drug solution in the nasal cavity was substantially increased by active administration using a syringe pump in a direction opposite to the MC into the nasal cavity.
In conclusion, the two methods of intranasal administration developed in this study can be expected to be extremely useful techniques for evaluating pharmacokinetics in rodents. The reverse cannulation method, in particular, could be useful for evaluating the full potential of nose-to-brain delivery of drug candidates.

Here, we describe two novel methods of stable intranasal administration under inhalation anesthesia with minimal physical stress for experimental animals. We also describe a method for quantitative evaluation of drug distribution levels in the brain via the nose-to-brain pathway using radiolabeled [14C]-inulin as a model substrate of water-soluble macromolecules.

Novos métodos para a Administração Intranasal sob anestesia por inalação para avaliar a entrega da droga de nariz-de-Brain

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain ...

Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper introduces a noninvasive method of intratracheal delivery of dry powder formulation in mice. A dry powder loading device that consists of a 200 &#181;L gel loading pipette tip connected to an 1 mL syringe via a three-way stopcock is presented. A small amount of dry powder (1-2 mg) is loaded into the pipette tip and dispersed by 0.6 mL of air in the syringe. Because pipette tips are disposable and inexpensive, different dry powder formulations can be loaded into different tips in advance. Various formulations can be evaluated in the same animal experiment without device cleaning and dose refilling, thereby saving time and eliminating the risk of cross-contamination from residual powder. The extent of powder dispersion can be inspected by the amount of powder remaining in the pipette tip. A protocol of intubation in mouse with a custom-made light source and a guiding cannula is included. Proper intubation is one of the key factors that influences the intratracheal delivery of dry powder formulation to the deep lung region of the mouse.

Dry powder formulations for inhalation have great potential in treating respiratory diseases. Before entering human studies, it is necessary to evaluate the efficacy of the dry powder formulation in preclinical studies. A simple and noninvasive method of the administration of dry powder in mice through the intratracheal route is presented.

Administração Intratraqueal de Formulação de Pó Seco em Camundongos

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

A Porcine Heterotopic Heart Transplantation Protocol for Delivery of Therapeutics to a Cardiac Allograft

Cardiac transplantation is the gold standard treatment for end-stage heart failure. However, it remains limited by the number of available donor hearts and complications such as primary graft dysfunction and graft rejection. The recent clinical use of an ex vivo perfusion device in cardiac transplantation introduces a unique opportunity for treating cardiac allografts with therapeutic interventions to improve function and avoid deleterious recipient responses. Establishing a translational, large-animal model for therapeutic delivery to the entire allograft is essential for testing novel therapeutic approaches in cardiac transplantation. The porcine, heterotopic heart transplantation model in the intraabdominal position serves as an excellent model for assessing the effects of novel interventions and the immunopathology of graft rejection. This model additionally offers long-term survival for the pig, given that the graft is not required to maintain the recipient's circulation. The aim of this protocol is to provide a reproducible and robust approach for achieving ex vivo delivery of a therapeutic to the entire cardiac allograft prior to transplantation and provide technical details to perform a survival heterotopic transplant of the ex vivo perfused heart.

We present a protocol for utilizing a normothermic ex vivo sanguinous perfusion system for the delivery of therapeutics to an entire cardiac allograft in a porcine heterotopic heart transplant model.

Um Protocolo de Transplante de Coração Heterotópico Porcino para Entrega de Terapêutica a um Aoenxerto Cardíaco

Cardiac transplantation is the gold standard treatment for end-stage heart failure. However, it remains limited by the number of available donor hearts ...