Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Preparação do Substrato para placas de 96 poços <ol><li> Criar um mapa da placa de 96 poços descrevendo os diferentes substratos e tipos de células a ser examinada (Figura 1). </li><li> Obter as soluções estoque de diferentes substratos [poli-L-lisina, fibronectina, colagénio do tipo I, laminina e colagénio IV-entactina-laminina (ECL)], uma placa de 96 cavidades com múltiplas cavidades e preparar uma estação de trabalho em uma cultura de células estéril capô. </li><li> Prepare substratos individuais por diluição em estoque estéril salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração final de 5 ug / ml (esta concentração foi previamente determinada baseada num ensaio dependente da concentração do substrato para o crescimento e proliferação de células). Misture usando um vortex antes de verter para um reservatório estéril. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de substrato a cada poço de acordo com o mapa de 96 poços (Figura 1) (uma micropipeta de 12 ou 8 canais é conveniente para micropipetting em uma placa de 96 poços). Selar a tampa para a placa de 96 poços, utilizando uma tira de Parafilm e armazenar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. celular Galvanização e tempo-lapso NOTA: Rato MSCs foram isoladas a partir da medula óssea de adultos C57BL / 6 e mantidas como uma linha de células aderentes. MSCs foram infectadas utilizando vectores lentivirais para engenheiro-los para secretar derivado do cérebro do factor neurotrófico (BDNF; cDNA humano) e glial factor neurotrófico derivado de células (GDNF; cDNA humano) utilizando de um vector lentiviral que codifica o BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF, GDNF-CMV-IRES-GFP), proteína fluorescente e verde (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). NOTA: Os meios de cultura para as células-tronco do rato mesenquimais (MSCs) é modificado meio de Iscove da Dulbecco contendo 10% de soro de hibridoma qualificado fetal bovino, 10% de soro equino, 2 mM de L-glutamina, e 10.000 U / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina . Os cinco tipos diferentes de MSCs mouse (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs e BDNF / GDNF-GFP-MSC) foram plaqueadas a cerca de 30% de confluência em frascos T75 de cultura de células. <ol><li> Celular Galvanização <ol><li> No dia seguinte, as soluções de substrato remover por aspiração e lavar cada cavidade com cerca de 200 ul de PBS estéril, duas vezes. Adicionar meio de cultura celular (200 ul / poço) a cada poço, após o enxaguamento final de PBS. Colocar a placa de 96 poços numa incubadora de cultura de células definido a 37 ° C e 5% de CO 2 por razões de equilíbrio. </li><li> Embora a placa de 96 poços é equilibrar na incubadora, a colheita das células (MSCs em frascos T75 deve ser de aproximadamente 70% confluentes no momento da colheita / metalização), recolhendo o meio de crescimento (como a que se refere aos meios condicionados) do frasco T75 e armazenar num tubo de 15 ml, sob condições estéreis (este meio condicionado será utilizado no passo 2.1.4). </li><li> Adicionar 8 mL de PBS estéril para o frasco e agitar suavemente e, em seguida, para fora da pipeta PBS e adicionar 1 ml de tripsina a 0,05% e 0,01%Solução de EDTA para desprender as células da superfície do frasco de cultura T75. Monitor de separação celular, exibindo o balão utilizando um microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase. </li><li> Quando as células têm destacado, imediatamente adicionar 8 ml de meio condicionado (coletados na etapa 2.1.2) para o balão. Recolha a suspensão de células e transferir para um tubo de 15 ml de centrífuga cónico e centrifugar durante 4 minutos a 450 xg para sedimentar as células. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 ul de fresco e aquecida (37 ° C), meios de cultura celular. </li><li> Determinar o número de células na suspensão de células através da realização de uma contagem de células viáveis ​​azul de tripano utilizando um hemocitómetro. Placa as células a uma densidade de aproximadamente 300 células / poço em poços apropriados da placa de 96 poços. </li><li> Repita essas etapas para cada população de células. </li></ol></li><li> Time-lapse imagem <ol><li> Depois de todos os MSCs foram banhados, lugara placa de 96 poços em uma incubadora durante 2 horas para permitir que as MSCs para anexar o substrato. </li><li> Inicie o sistema HCS e esperar por 2 horas para o sistema atinja o equilíbrio. Definir o controlador ambiental a 37 ° C e ligar-se um cilindro de gás misturado contendo 5% de CO 2 em ar para o sistema de câmara ambiental HCS fornecimento de uma fonte de ar constante. </li><li> Remova a placa de 96 poços da incubadora a seguir ao período de equilíbrio de 2 horas e colocar directamente para a câmara de crescimento de células do sistema de HCS. Permitir 30 min para o equilíbrio para explicar qualquer expansão relacionada com o calor da placa e, em seguida, começar a aquisição e análise de imagem do software para configurar as definições de placa. </li><li> Selecione o objetivo 20X para a imagem latente. Selecione dois poços por condição [ie, GFP-MSCs em Fibronectin etc. (6 substratos x 5 subtipos MSC para um total de 30 condições x 2 repetições = 60 poços no total)] para a criação de imagens de lapso de tempo. Escolha dois locais para a imagem latente comem cada poço. </li><li> Escolha os comprimentos de onda de luz corretos para criação de imagens. NOTA: Dois comprimentos de onda diferentes (contraste de fase e fluorescência da GFP) foram selecionados para geração de imagens de lapso de tempo. </li><li> Concentre-se no bem inferior utilizando a focagem automática a laser e tomar imagens de teste para vários sites e vários poços para encontrar um plano focal otimizado. </li><li> Uma vez que o foco tenha sido estabelecido, iniciar a captura de imagens a cada 5 minutos durante 48 horas para todos os 60 poços (120 sites). </li><li> Alimentar as células a cada 24 h, removendo a placa de 96 poços a partir do sistema de HCS. Retirar 75 ul de meio de cada poço e adicionar 100 uL de meio fresco a cada poço (equilibrar este meio fresco a 37 ° C e 5% de CO 2). </li><li> No final da experiência de lapso de tempo, remover a placa de 96 poços a partir do sistema de HCS. Sob condições estéreis, recolher as amostras de meio condicionado de cada poço e transferir estas amostras para outra placa de 96 poços. NOTA: As amostras podem ser utilizadas para outras analysé através da realização de ELISA para os factores neurotróficos. </li><li> Preparar a placa de 96 poços com MSCs cultivadas para ensaios adicionais, tais como ensaio de proliferação celular Ki67 ou iodeto de propídio ensaio de coloração vivo / morto (ver detalhes abaixo). </li><li> Realizar análise de imagens de lapso de tempo para a célula de acompanhamento da migração / célula, conforme descrito no item 5 abaixo. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 proliferação celular e iodeto de propídio Vivo / Dead Assay <ol><li> Ensaio de proliferação celular Ki67 (imunocitoquímica) <ol><li> Lavar as culturas de células com 0,1 M de fosfato (PO 4) tampão durante um minuto duas vezes. Fixar a cultura com 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente. Retire a PFA e lavar os poços com PBS durante sete minutos, três vezes. </li><li> Após a lavagem final, adicionar 100 ul de solução bloqueador (solução salina de tampão fosfato, 5% de soro de burro normal, 0,4% de albumina sérica bovina e 0,2% de Triton X-100) a cada poço umand incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Prepare o anticorpo primário, anticorpo de coelho anti-Ki67, por diluição em solução bloqueador numa razão de trabalho de 1: 200. </li><li> Remover a solução de bloqueador e aplicar a 100 ul de solução de anticorpo primário em cada poço. Cobrir a placa de 96 poços e incuba-se as amostras a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, remover a solução de anticorpos e enxaguar com PBS durante 7 min, 3 vezes. </li><li> Prepare o anticorpo secundário, de burro anti-coelho de Cy3 em solução de bloqueio a uma razão de trabalho de 1: 500. Adicionar corante nuclear DAPI para a solução de anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 100. Após a remoção da última lavagem de PBS, aplicam-se 100 ul da solução de anticorpo / DAPI secundário para cada poço. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 90 min. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário / DAPI e lavar cada poço com PBS durante 7 min, 3 vezes. Cobrir a placa de 96 poços e armazenar a 4 ° C até à imagiologia. </li></ol></li><li> Propidium Iodeto Vivo / Dead Assay <ol><li> Medir a morte celular por iodeto de propídio (PI) ensaio de exclusão, tal como descrito abaixo. </li><li> Preparar a solução corante de iodeto de propídio, a uma concentração de 1,5 uM em meio de cultura. </li><li> Adicionar 100 ul de etanol a 70% para um poço de MSCs durante 2 minutos com o objectivo de matar essas células. Este poço serve como um controlo positivo para a mancha PI. A maioria dos MSC será indicando morte celular corada-PI. Remover a solução de etanol. </li><li> Adicionar 100 ul de solução corante de iodeto de propídio a cada poço e incubar durante 20 min a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> Lavar as células com tampão de fosfato 0,1 M durante 1 minuto, duas vezes. Fixar as células com PFA a 4% em tampão H P0 4 a 0,1 durante 20 minutos à temperatura ambiente. Retire a PFA e enxaguar com PBS três vezes por 7 min. </li><li> Incubar com solução DAPI (1:50) diluído em solução bloqueador durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave todos os poços comPBS durante 7 min, 3 vezes. </li><li> Remover a solução de DAPI e lavar cada poço com PBS durante 7 min, 3 vezes. Cobrir a placa de 96 poços e armazenar a 4 ° C até à imagiologia. </li></ol></li></ol> Análise 4. Automated Imaging and Multiwavelength Scoring <ol><li> Carregar uma placa de 96 poços (anteriormente transformadas por imunomarcação de Ki67 ou iodeto de propídio manchado de) no sistema HCS e permitem que a placa equilibrar durante 20 min Abra aquisição e análise de imagem do software do sistema HCS. </li><li> Escolha as configurações de aquisição para a objetiva de 10X usando câmera binning a 1 e um ajuste de ganho de 2. Encontre o Z-plano, no qual as células residem, utilizando a função Auto Exposição e calcular o deslocamento para cada comprimento de onda de interesse. Para esta análise, capturar imagens para DAPI (W1), Cy3 (W2) e FITC (W3). Escolha o nível de intensidade máxima em que os poços de controlo negativo não mostram nenhum sinal de aquisição de imagem. Confirme esta configuração é adequada para o pospoços tivo. </li><li> Adquirir placa. Capturar imagens e armazená-los na aquisição de imagem e de banco de dados do software de análise. </li><li> Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, imagem aberta aquisição e análise de software off-line e avaliação de placas de dados a partir das imagens adquiridas anteriormente. </li><li> Selecione a análise de pontuação Multi-comprimento de onda. Configure o intensidades mínimas e máximas para cada comprimento de onda. Nota: A detecção DAPI deve marcar a coloração ao redor de cada núcleo visível. Cy3 deve detectar as células positivas com Ki67 imunoreactividade (IR) e não deve detectar IR sob os controlos negativos. Para Cy3 Ki67 IR, a largura mínima aproximada foi de 7 mm, largura máxima aproximada foi de 30 mm, a intensidade acima do fundo local, foi de 150 níveis de cinza, e área manchada a mínima foi de 50 mm 2. </li><li> Executar análise para todas as posições. Exportar os dados para ver em planilha. </li></ol> Rastreamento 5. celular <ol><li> Abrir imagem acquisition e programa de análise e clique em &quot;revisão placa de dados [DB] ...&quot;, selecionando a placa de interesse. </li><li> Veja os dados como &quot;Time vs. Bem&quot;. </li><li> Escolha um dos sites da seção &quot;Sites&quot; clicando com o botão esquerdo na seleção desejada. Selecione &quot;Transmitido ...&quot; sob o título &quot;Os comprimentos de onda:&quot;. Botão direito do mouse sobre o alvo bem no modelo de placa de 96 poços e clique em &quot;Carregar imagens&quot;. </li><li> Acompanhe as células, clicando sobre os &quot;Aplicativos&quot; e, em seguida, &quot;Objetos faixa&quot;. </li><li> Use &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot; para escolher o formato para exportar os dados, por exemplo, o Microsoft Excel. </li><li> Escolha os dados de controle de exportação, por exemplo, o tempo decorrido, o número de objeto, a distância, intervalo de tempo, velocidade, ângulo absoluto, distância de origem, delta x e y delta. </li><li> Marcar cada célula de interesse com &quot;tecla Ctrl + clique esquerdo&quot; nas células-alvo. </li><li> Células Pista. Se necessário, parar / alterar rastreamento indevido de células com a tecla &quot;Esc&quot; e, em seguida, ajustar as configurações. </li><li> Após rastreamento celular está completo, salvar os dados com &quot;Log de dados&quot;. </li></ol>

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Taxas de publicação deste artigo vídeo foram apoiados por Molecular Devices, LLC.

As células estaminais mesenquimais (MSCs) adultos são um tipo de célula atractivo para o desenvolvimento de uma estratégia experimental combinando uma terapia baseada administração celular e genética. MSCs são multipotentes, capazes de se diferenciar em células de linhagem mesodérmica, e exibir plasticidade considerável, diferenciação / transdifferentiating em linhagens neuronais e gliais com a indução apropriado paradigmas 17,18. Além disso, as MSC foram transplantados e provou ser eficaz em estudos pré-clínicos para um número de distúrbios, incluindo condições neurodegenerativas 19. A eficácia terapêutica do MSC é bem conhecida devido à sua benéfica anti-proliferativos, anti-inflamatórias e anti-apoptóticos actividades 20. MSCs também são conhecidos por produzir e secretar vários fatores neurotróficos e crescimento, o que provavelmente contribui para as qualidades neuroprotetoras associados com MSCs ingênuos após o transplante em locais de lesão ou doença 21. Importantly, as MSCs pode ser geneticamente modificada para a libertação prolongada de factores neurotróficos para aplicações de terapia génica baseada em celular e combinados e têm sido utilizados num certo número de modelos animais de lesão ou doença do SNC 11,19,22. No desenvolvimento de uma estratégia baseada em terapia celular e de genes combinados, é importante que a saúde das células é verificada cuidadosamente antes da sua utilização in vitro extensiva, e especialmente em aplicações in vivo. Como prova de conceito, investigou várias populações de linhas de engenharia e controle MSC, a fim de estudar as consequências das modificações genéticas sobre a saúde celular e fitness usando uma abordagem de triagem alto teor (HCS). Em geral, refere-se a HCS celular high throughput screening com base em imagens 14. Esta abordagem de triagem permite uma avaliação quantitativa dos fenótipos celulares em múltiplos níveis de espacial (celulares para subcelular) e temporais (milésimos de segundo para dias) resolution em várias condições experimentais. Usando esta abordagem foi acessado possíveis diferenças de preferência substrato sobre os seguintes parâmetros: a proliferação, a expressão da proteína verde fluorescente (GFP), a morte celular, a mobilidade celular e / migração. As experiências foram concebidas em formato de 96 poços da placa de cultura de células. Dentro de uma única placa que são rotineiramente investigadas possíveis diferenças relacionadas com o substrato, com respeito a cada parâmetro para as diferentes populações de células MSC transduzidas com lentivírus e os MSCs modificadas em comparação com o original, MSC não transduzidas. Isto proporcionou um meio para comparar directamente os resultados para os diferentes subtipos de MSC com uma bateria de ensaios in vitro, tais como a proliferação de células utilizando imunomarcação de Ki67, ensaio de viabilidade de células vivas / mortas utilizando coloração com iodeto de propídio, e o comportamento das células através da realização de imagens digitais de lapso de tempo . Como uma extensão deste HCS também se pode realizar os testes ELISA em amostras de meio condicionado coletados de w indivíduoells para determinar quantitativamente a secreção de factores neurotróficos. O meio condicionado a partir de diferentes subtipos MSC pode também ser utilizado em bioensaios in vitro para determinar a actividade biológica de factores secretados 11,23. Este tipo de plataforma HCS também pode ser usado para as medições in vitro de crescimento de neurites a partir de culturas neuronais primárias e linhas de células estaminais neurais 24. Em geral, os nossos resultados demonstraram que as subpopulações das MSCs modificadas geneticamente apresentaram comportamento semelhante em comparação com as MSCs não modificados. A influência de diversos substratos de cultura no crescimento das células e a migração das células não foi significativamente diferente entre os subtipos de MSC, bem como substratos de cultura. Como tal, os substratos de matriz extracelular testados não parecem desempenhar um papel crítico na modulação destes aspectos do comportamento celular para estas MSCs Engineered diferentes. Este estudo demonstra a utilização de um sistema de análise de HCS diferenaspectos t de comportamento celular. No entanto, não é raro encontrar limitações associadas com análise de imagem. Na ocasião, enquanto analisando as imagens de fluorescência, era um tanto difícil de determinar o valor limiar acima do qual correcta immunolabeled ou células coradas seria contado como positivamente marcado / manchado. Assim, para minimizar o viés subjectivo, a determinação dos limiares era dependente de uma comparação com controlos (controlos negativos para imagens de fluorescência foram realizadas em paralelo, durante todo o processamento pela omissão dos anticorpos primários ou secundários). Outra limitação foi encontrado durante a análise da migração de células usando imagens digitais de lapso de tempo-. Em alguns casos, o software de imagem não foi capaz de diferenciar entre o movimento Browniano aleatório de uma célula contra uma célula realmente fazer a migração apenas uma distância muito curta. Outras limitações foram evidentes em situações em que o software de análise não é capaz de distinguir a presença de multipcélulas Le em muito próximo de um outro. Para superar esta limitação necessária selecção manual de células durante a análise ao invés de uma análise totalmente automatizado. Densidade de plaqueamento celular também pode resultar em dados de inclinar a migração celular entre as populações de células que exibem uma maior preferência para crescer em aglomerados contra células que crescem de forma isolada umas das outras. Estes tipos de diferenças são em parte provavelmente um reflexo da célula-substrato contra preferências célula-célula. Usando um sistema de HCS para adquirir imagens e executar análise de dados fornece um meio eficiente e rápido para avaliar vários parâmetros celulares. Além disso, o time-lapse de vídeos digitais para 30 condições diferentes (seis substratos e 5 subtipos MSC diferentes) foram rotineiramente adquirida por períodos que variam de horas a dias (48 horas) durante o uso da câmara ambiental. Estes dados foram posteriormente utilizadas para calcular e determinar as diferenças nas taxas de migração de células em várias linhas celulares em ECM diferentemoléculas. Neste relatório, nós destacamos a implementação de uma plataforma de triagem de alto conteúdo para avaliar a saúde e função das células. Este tipo de análise é útil para o desenvolvimento de estratégias racionais para a concepção de tipos de células, bem como os substratos de polímero para facilitar o crescimento celular e a regeneração neural dirigida. Este é um passo essencial para a aplicação da entrega à base de células-tronco de fatores terapêuticos antes da extensa em estudos pré-clínicos in vivo utilizando estratégias de transplante de células.

Um grande problema com a aplicação terapias úteis para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso é no desenvolvimento de métodos eficazes que impedem uma maior degeneração e também facilitar a recuperação da função. Uma estratégia inovadora é geneticamente células-tronco engenheiro ex vivo, para a produção de fatores neuroprotetores, antes da sua transplante. Esta combinação de terapia com base em células, acoplada com um tipo de terapia genética, fornece um método poderoso para o tratamento de doença ou morte neuronal induzida por lesão no sistema nervoso. Os factores neurotróficos são essenciais para o crescimento e sobrevivência de neurónios em desenvolvimento, bem como manutenção e plasticidade de neurónios maduros. Um certo número de estudos demonstraram um papel significativo de factores neurotróficos na promoção do crescimento inicial e diferenciação de neurónios no sistema nervoso central e periférico (SNP e do SNC) e também pode estimular a regeneração in vitro e numanimal modelos de lesão neural 1. O factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é altamente expresso no sistema nervoso central e desempenha um papel importante na regulação do desenvolvimento neuronal, plasticidade sináptica e reparação 2. -Linha derivada de células da glia factor neurotrófico (GDNF) promove a sobrevivência de muitos tipos de neurónios, incluindo neurónios motores dopaminérgicos e 3. Assim, uma estratégia importante para a reparação neural é o de proporcionar fontes exógenas de factores neurotróficos para as regiões lesionados ou doentes do sistema nervoso. As células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea multipotentes (MSCs) possuem um grande potencial para a administração de proteínas terapêuticas para tratar o sistema nervoso danificado ou doente. Transplante de MSCs atraiu considerável atenção nos esforços para desenvolver terapias baseadas em células compatíveis paciente uma vez que têm uma série de vantagens, incluindo, 1) relativa facilidade de obtenção e manutenção, 2) capacidade multipotencial, 3) preocupações éticas pouco, 4) Capacidade de sobreviver e migrar após o transplante e 5) potencial para o transplante autólogo 4,5. Resultados promissores foram relatados com o uso de MSCs ingênuos e geneticamente modificadas em modelos animais para um número de diferentes condições neurodegenerativas, incluindo a lesão da medula espinhal 6,7, acidente vascular cerebral 8,9, a deficiência de mielina 10, e degeneração da retina 11-13. Acoplamento transplante de células com a entrega de fatores neurotróficos a partir de células-tronco geneticamente modificadas é um romance e importante estratégia de reparo neural. Um passo essencial no desenvolvimento de sistemas de libertação terapêuticos de factor de base celular é determinar a saúde normal das células modificadas. Como tal, o principal objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros de crescimento gerais de células-tronco adultas geneticamente modificadas. Uma abordagem importante para uma avaliação rápida de vários parâmetros celulares é empregar celular de alta através de triagens com base em imagensg (HTS), muitas vezes referido rastreio conteúdo tão alto (HCS) procedimentos 14. Esta tecnologia permite a aquisição e análise de imagem automatizado, e esta abordagem é particularmente bem adaptado para aplicações de investigação de células estaminais. Neste projeto foi desenvolvida uma plataforma de criação de perfil que permite a rápida caracterização e otimização das preferências substrato celular e funções celulares com células-tronco adultas geneticamente modificadas empregando um sistema de HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Parâmetros de crescimento MSC foram examinados por cultura das diferentes populações de MSCs em diferentes substratos. Os cinco diferentes populações de subtipos de MSC (MSC GFP-MSCs, o BDNF-GFP-MSCs, o GDNF-GFP-MSC, e BDNF / GDNF-GFP-MSC) foram plaqueadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos pré-revestidas com o diferente substratos como ilustrado na Figura 1. Após quatro dias de cultura, as placas foram fixadas e immunolabeled e / ou corada com os reagentes apropriados e, em seguida, examinadas usando o sistema de HCS e as análises efectuadas com o programa de aquisição de imagem e análise de software. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1:. Molde placa de 96 poços para o design experimental placas de 96 poços foram revestidas com vários substratos e os poços foram semeadas com células estaminais Engineered como mostrado no modelo. Como um exemplo, apenas microcavidadels em linhas BF foram utilizados neste experimento. Linhas A, G e H foram deixados vazios. Abreviações - CTM: células-tronco mesenquimais; GFP-MSCs: verde fluorescente MSCs que expressam proteínas; BDNF-GFP-MSCs: derivado do cérebro factor de MSCs que expressam GFP-neurotróficos; GDNF-GFP-MSC; Glial derivada de células que expressam o factor de MSCs-GFP neurotróficos; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF e GDNF expressando GFP-MSC; ECL: entactina-Collagen IV-A laminina). Anti-Ki67 de imunomarcação, seguida por contrastação com DAPI, foi utilizada para avaliar se os diferentes substratos influenciado proliferação das diferentes populações de MSCs modificadas (Figura 2A). A expressão do antigénio Ki67 ocorre preferencialmente durante tardias G 1, S, G2 e M as fases do ciclo celular, e não é detectada em células em fase de repouso a 0 (G), e, por conseguinte, é útil como um marcador para a proliferação celular 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) é um nu utilizadacounterstain clara e cromossomo que emite fluorescência azul na ligação a AT regiões do DNA 16. O número total de células em um campo pode ser determinada pela contagem do número de núcleos corados com DAPI. Tal como ilustrado na Figura 2B, embora tenha havido variações nas percentagens de MSCs em proliferação, todos os substratos, no entanto, a proliferação celular considerável suportado por cada um dos subtipos de MSC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: Ensaio de proliferação celular Ki67. (A) Mesclado, imagem double-fluorescente de Ki67 imunomarcação (vermelho) e DAPI (azul) de coloração nuclear. Muitas das MSCs foram immunolabeled com o anticorpo Ki67 (vermelho). Escala da barra = 50 m. (B) O gráfico de barras que ilustra as percentagens de Ki67 imunomarcadas subtipos MSC cultivadas em poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), a fibronectina, o colagénioTipo I, laminina, ou entactina-colágeno IV-laminina (ECL) substratos durante 5 dias in vitro (DIV). N = um experimento. Cada barra representa uma média de dados obtidos a partir de 8 sites fotografada a partir de 2 poços para cada condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Iodeto de (PI) coloração de propidio foi utilizada para avaliar se substratos diferentes influenciada sobrevivência celular (Figura 3). O iodeto de propídio é um cromossoma nuclear e contracorante vermelho fluorescente vulgarmente utilizados. O iodeto de propídio é impermeante de membrana e geralmente excluídos das células viáveis ​​e, assim, é útil para detectar células mortas numa população. A proporção de células mortas dentro de uma dada condição pode ser determinada quando combinado com um marcador nuclear geral tal como DAPI para identificar todas as células dentro de um campo. A porcentagem de células PI-positivos foi baixa em todos os substratos analisados ​​(A Figura 3). Como um controlo positivo para o reagente de PI, alguns poços contendo as MSCs foram incubadas em 70% de etanol, uma condição conhecida para matar a maioria das células, o que resulta numa alta percentagem de células marcadas com PI como ilustrado na Figura 3B e 3C (etanol tratado positiva controlo). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: Ensaio de morte de células iodeto de propídio. (A) Mesclado, imagem fluorescente duplo para iodeto de propídio (vermelho) e DAPI (azul) de coloração. Embora os núcleos de todas as células viáveis ​​foram coradas com DAPI (azul), sem coloração com iodeto de propídio foi detectado no MSC. (B) Praticamente todas as MSCs foram coradas com iodeto de propídio a seguir a exposição a etanol a 70%. As barras de escala em A e B = 100 mm. (C) Gráfico de barras que ilustra as percentagens de iodeto de propídio (PI) corado subtipo MSCs cultivadas em poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), a fibronectina, o colagénio do tipo I, laminina, colagénio ou entactina-IV-laminina (ECL) substratos, durante 5 dias in vitro (DIV). Controlo Etanol: Esta condição serviu como um controlo positivo para o reagente de coloração de PI. A maioria das células submetidas a PI mancha após o tratamento de etanol estão mortos e, assim, corou positivamente para o reagente PI. N = um experimento. Cada barra representa uma média de dados obtidos a partir de 8 sites fotografada a partir de 2 poços para cada condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para investigar a possível influência de diferentes substratos sobre o comportamento de MSCs de engenharia, a migração celular foi analisada por microscopia digital de time-lapse e do sistema de câmara de luz transmitida / ambiental no sistema de HCS (ver Suplementar Video 1). Vários sites / poço foram time-lapse fotografadae utilizados para calcular as taxas de migração celular para os diferentes sub-populações de MSCs que crescem em diferentes substratos utilizando o programa de software de aquisição e análise de imagem. Em geral, conforme mostrado na Figura 4C, todos os subtipos de MSCs mostraram a taxa de migração mais rápida sobre as superfícies revestidas com matriz extracelular (fibronectina, colagénio, laminina e ECL) e o mais lento em superfícies de poliestireno não-revestidas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. Rastreamento celular e migração MSCs rastreados com aquisição de imagem e software de análise. Imagens Overlayed de transmissão de luz e imagens de fluorescência (A) o início da imagem time-lapse e (B) em 29 horas mais tarde, no final da sessão de imagem time-lapse (ver Suplementar Video 1). Faixas de migração celular estão indicadas pelo li cornes. Escala da barra: 50. Gráfico mm (C) de barras que ilustra as taxas de migração média (expressa como mm / h) para os subtipos de MSC cultivadas em poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), a fibronectina, o colagénio tipo I, laminina, ou entactina-colágeno IV-laminina (ECL) substratos para 2 dias in vitro (DIV). N = um experimento. Cada barra representa a média de pelo menos 10 células fotografada a partir de 2 poços para cada condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tomados em conjunto, estes resultados fornecem evidência preliminar de que estas subpopulações de MSCs modificadas geneticamente exibir propriedades de crescimento semelhantes. Estes resultados fornecem evidências convincentes de que o lentivírus mediada alterações genéticas dessas MSCs não induziu efeitos deletérios detectáveis ​​dramáticos sobre os parâmetros de crescimento investigados usando esta plataforma de triagem. Suplementar vídeo 1. Time-lapse de vídeo digital de rastreamento MSC utilizando o programa de software de aquisição e análise de imagem. O caminho de migração é para dois MSCs [indicados como 1 (linha de rastreamento verde) e 2 (linha de rastreamento azul)] são ilustrados. Vídeo capturado durante um período de 29 horas. As imagens foram capturadas a cada 5 minutos. Imagens de fluorescência de MSCs expressando GFP foi usado para geração de imagens de lapso de tempo na preparação do vídeo. Bar Calibração = 50 mm. Este tipo de análise é útil para investigar comportamentos de células, incluindo a migração celular e divisão celular.

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Medicina

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Transplante de Células-tronco Estratégias para a Restauração da disfunção cognitiva causada pela radioterapia craniana

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...