Agradecemos a Dr. Wenjin Chen pela ajuda com o programa MATLAB e do Instituto do Câncer de Nova Jersey e histopatologia instalação de microscopia. Agradecemos também aos revisores por seus comentários e sugestões. Este estudo é apoiado pela Raymond e Beverly Sackler Research Foundation.

1. Preparação de 1% de agarose-revestido placa de 24 poços <ol><li> Adicionar 1 g de agarose (RPI, A20090-500) a 100 ml de água desionizada num frasco ml 250-500 e autoclave para esterilizar a agarose (121 ° C, 15 psi, 15 min, em uma máquina de autoclave). Transferir a garrafa com agarose esterilizado em um banho de água 70 ° C. A agarose está pronto para ser derramado quando é arrefecida a 70 ° C, o que demora cerca de uma hora. Certifique-se de manter o estéril agarose em todos os momentos. </li><li> Obter os 24 poços de fundo plano (Falcon placas, 353,047); qualquer tipo de 24 poços de fundo plano Placas funcionaria se as placas podem ser visualizados sob um microscópio de contraste de fase. </li><li> Dispense 200 ul de agarose a cada poço com uma pipeta Eppendorf repetidor em uma cabine de segurança biológica e agite a agarose em torno do bem para torná-lo cobrir o bem de forma uniforme. 200 ul de agarose é adequado para formar uma superfície côncava de modo a que esferóides podem formar as formas consistentes esféricas. Menos de 200 ul de agarose não podecobrir o bem inteiramente, mas mais do que 200 ul de agarose não pode formar a superfície côncava e os esferóides cultivadas em que não podem formar formas esféricas. </li><li> A agarose revestidas placas de 24 poços estão prontos para ser utilizados em cerca de 10 min. (Opcional) Adicionar 100 ul de meio para equilibrar a agarose com meio de cultura antes de células de semeadura. </li><li> Alternativamente, após a agarose é totalmente solidificados, adicionar 100 meio de crescimento uL a cada poço e selar as placas com a fita de vedação estéril (Nunc, 236,366). Estas placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 2. Preparação de suspensões de células únicas <ol><li> Todas as experiências são realizadas utilizando as técnicas padrão assépticas num armário de segurança biológica e todas as culturas são crescidas em um 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar, a menos que especificado. </li><li> Pancreático humano NET Bon-1 células são mantidas em DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) com 10% de soro fetal bovino (FBS, Invitrogen,16000-044 médio) em uma de 100 mm x 20 mm prato de cultura estéril tecido (Corning, 430,167). </li><li> Quando monocamada Bon-1 das células atingirem 70-80% de confluência, o meio é removido. As células são lavadas com PBS duas vezes, e desalojado do prato por adição de 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) com 5 minutos de incubação a 37 ° C. TrypLE é semelhante à tripsina, mas é estável a 15 - 30 ° C, bem como a 4 ° C. Confira ao microscópio para se certificar de todas as células são separadas do prato. </li><li> Adicionar 9 ml de meio de crescimento das células tripsinizadas e usar uma pipeta para pipetar células para cima e para baixo algumas vezes para assegurar uma suspensão de células até único. </li><li> Use 70-iM célula coador (Fisher, 22.363.548) para filtrar as células. </li><li> Recolher células e realizar uma contagem de células utilizando goiaba PCA-96 Sistema de Base (Millipore). </li><li> Preparar uma suspensão de 5.000 células por ml em fenol livre de DMEM/F12 com meio de crescimento 10% de FBS. </li></ol> 3. Cultura esferóide <ol><li> Overlay ul 200 do únicoAs suspensões de células para a agarose revestido placa de 24 poços e selar as placas de 24 poços com a fita de vedação estéril para evitar a evaporação. </li></ol> Nota: - O número de células a serem plaqueadas deve ser determinado empiricamente com base no tamanho dos esferóides no dia 6; 300-400 diâmetro iM dos esferóides seria o tamanho ideal para o início do tratamento com drogas; 1000 BON-1 e H727 células são semeadas. - Não é recomendável partida tratamentos com drogas após o dia 6, porque a viabilidade das células 3D começa a cair a cerca de 10 dias (dados não mostrados, manuscrito em preparação). <ol start="2"><li> Colocar os acima de agarose revestidas placas de 24 poços com BON-1 células sobre um agitador orbital a uma agitação muito lenta de menos de 40 rpm durante a noite num 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar. Em seguida, estas placas mover para uma plataforma estável para manter as culturas em crescimento. </li><li> Adicionar 200 uL de meio de crescimento cada poço da placa acimas cada 3 dias. Não perturbe os esferóides. Tentar adicionar médio através da parede de cada poço, tocando a ponta da pipeta para o lado do poço, e deixando que o fluxo médio para baixo para dentro do poço. </li><li> Monitorar a formação esferóide nas placas de 24 poços sob um microscópio. </li></ol> 4. Tratamento de Drogas <ol><li> Quando os esferóides atingir cerca de 300-400 um de diâmetro no dia 6, os esferóides 3D são tratados com a droga. Este é denotado como 0 dias de tratamento da toxicodependência. </li><li> No dia 6, cada poço da placa contém cerca de 400 ul de meio. Para garantir que os tratamentos com drogas estão em concentração final 1x em cada poço, 3x diluições em série de cada dose de tratamentos são feitos a partir da reserva de fármaco em meio de crescimento 5 ml num tubo de 15 ml, o que é suficiente para 8 repetições. </li><li> Os esferóides em cada linha da placa de 24 cavidades são categorizados como veículo, a dose de 1, 2, 3, 4 e 5. Existem quatro réplicas para cada dose de tratamentos em uma placa de 24 poços (ver <strong&gt; Tabela 1). Nós geralmente tratar esferóides 3D pelo menos em 2 placas de 24 poços, que faz com que, pelo menos, 8 repetições para cada dose de tratamentos. </li><li> Girar para baixo a placa de 24 poços a 800 rpm durante 5 min a 4 ° C para se certificar de que todas as condensações sobre a fita de vedação ir para dentro do poço. Devido à característica flutuante dos esferóides 3D, o meio em cada poço não é removido para evitar a perturbação dos esferóides. </li><li> Adicionar cuidadosamente 200 ul dos tratamentos acima feita de cada dose nos poços apropriados ao longo da parede de cada poço. </li><li> Selar as placas de 24 poços com a fita de vedação e incubar as culturas no 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 em ar. </li><li> Se necessário, recuar os esferóides em cada poço com a respectiva dose de tratamentos após 72-96 horas. </li></ol> 5. Monitor 3D Culturas esferóides <ol><li> Em cada ponto de tempo escolhido após tratamentos com drogas (0, 24, 48, 72 hr), os esferóides em cada poço de t24-ele bem placa são gravadas com um microscópio Zeiss Axiovert de contraste de fase 200/M-based usando uma objetiva de 5x. </li></ol> Nota: As imagens podem ser tomadas em qualquer microscópio de luz com uma escala calibrada entre mM e pixel. A objetiva de 5x, é ideal porque os esferóides rapidamente ultrapassar o campo de imagem com uma objetiva de 10x. <ol start="2"><li> Esferóide análise pode ser realizada manualmente, utilizando Zeiss AxioVision 4.8.2 Software com as imagens brutas. </li><li> Alternativamente, um costume desenvolvido programa MATLAB é utilizado para estimar o tamanho dos esferóides automaticamente / semi-automática. O programa automático implementa o algoritmo contorno activo 4 para localizar com precisão o contorno do esferóide em uma determinada imagem e medir a sua maior (L) e menores (W) eixos automaticamente. Uma versão semi-automática do mesmo algoritmo permite que os usuários para ajudar a iniciar o programa quando artefato forte está presente. Todas as imagens precisam ser exportada como TIFF ou JPEG de formatos de arquivoNas imagens originais para serem lidos pelo programa. O volume do esferóide é estimada como 0,5 x L x W 2. </li></ol> 6. HistoGel incorporação dos esferóides-3D Net <ol><li> 10-24 esferóides são recolhidos a partir das placas de 24 poços, lavou-se duas vezes em PBS, fixadas em formalina a 10% durante 2 horas, lavou-se em 50% e etanol a 70% durante 15 min, duas vezes, respectivamente, e estão prontos para incorporação HistoGel. Alternativamente, eles podem ser mantidos em etanol a 70%, a 4 ° C durante vários meses. </li><li> Um tubo de frio HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) é colocada num copo cheio com água. A proveta é aquecida num microondas durante 1 min ou até que o gel é completamente liquefeito, depois mantido no copo cheio de água mesma em todos os momentos. </li><li> Os esferóides em etanol a 70% a partir de cima são transferidos para um cryomold biópsia (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) usando um palito de dentes. Certifique-se de todos os esferóides são transferidos. Deixe os esferóides sentar-se por um minuto a afundar para baixo para o fundo do biopsy cryomold. Tente se livrar dos líquidos no cryomold biópsia com Kimwipes e, entretanto, muito gentilmente empurrar os esferóides ao centro na parte inferior do cryomold biópsia usando o plástico descartável pipeta Pasteur. Este passo pode ser mais fácil de ser feita sob um microscópio de dissecação. </li><li> Uma fina camada de HistoGel aquecido é adicionado à cryomold biópsia para estabilizar os esferóides, na parte inferior do cryomold biópsia; por sua vez, o palito é usado para manter os esferóides no centro, na parte inferior do cryomold biópsia muito suavemente. Não adicionar HistoGel muito, mas apenas o suficiente para estabilizar os esferóides, na parte inferior do cryomold biópsia. </li><li> Deixe os esferóides / HistoGel sentar-se por 1-2 minutos à temperatura ambiente ou até que o HistoGel é solidificado. Em seguida, preencha o resto do cryomold biópsia com o HistoGel aquecido. </li><li> Permitir que a solidificar à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. </li><li> Pouco antes de estalar os esferóides / bloco HistoGel do cryomold biópsia, leave-lo a 4 ° C durante 1 min, o que ajuda a estalar os esferóides intacta / bloco HistoGel. Os esferóides / bloco HistoGel é então envolto em um pedaço de Bio-wraps (Surgipath, 01090) e colocar em um tecido e cassete biópsia (Fisher Scientific, 15-182-701D). O tecido e cassete biópsia é armazenado num recipiente com etanol a 70%. Em seguida, os procedimentos de tecido de rotina de processamento de parafina são seguidos. 5 </li><li> O bloco de parafina pode ser seccionado em 3-iM lâminas camada espessa. As lâminas podem ser corados com hematoxilina e eosina para determinar as alterações histológicas e também pode ser utilizado para a coloração imuno-histoquímica. </li></ol> 7. Os resultados representativos Pancreático humano linhas tumorais neuroendócrinos células BON-1 (fornecido a Verto Instituto por Kjell Oberg, Uppsala University, Suécia), QGP-1 (Japanese Health Sciences Foundation, Osaka, Japão), e neuroendócrino tumor de pulmão humano de células da linha H727 (ATCC) foram cultivados num agarose-revestido placa de 24 cavidades. Como visto na Figura 1, as três linhas de células mostram a morfologia diferente. Células BON-1 e H727 formado esferóides 3D. Sob o microscópio, as células apresentaram H727 esferóides mais apertados e mais compacto que o Bon-1 células. Nós supomos que a H727 células têm uma capacidade maior de adesão célula-célula e formam junções apertadas como resultado. QGP-1 células mostram grandes uva como massas porosas, que não são considerados esferóides. Devido ao interesse crescente de pesquisa pancreática tumor neuroendócrino nos últimos anos, BON-1 células são utilizadas para o resto das figuras. Após espalhar Bon-1 células na agarose revestido placa de 24 poços, a formação de esferóides multicelular ocorre tipicamente por º dia 3 rd ou 4 e os esferóides tornar-se mais redondo pelo dia 6 th. Devido à limitação de nutrientes e de oxigénio, as células do núcleo denso dos esferóides começam a morrer por volta do dia 10 e por dia 17, os esferóides começam a desintegrar-se, devido ao grande tamanho ou na formame os casos, a ejeção do núcleo necrótico. Os esferóides tipicamente pode crescer até 1.000 m de diâmetro. A Figura 2 mostra as secções da formação de crescimento, e desintegração do Bon-1 esferóides 3D. Os tratamentos medicamentosos foram iniciadas quando esferóides foram em torno de 300-400 mM e células retidas alta viabilidade (manuscrito em preparação). Dia 6 esferóides 3D foram escolhidos como ponto de partida para os tratamentos com medicamentos. Tem sido relatado que os inibidores da histona mostraram efeitos antiproliferativos e proapoptóticos sobre as células NET. 6 Nós escolhemos a histona-desacetilase inibidor Tricostatina-A 3A (TSA), como um exemplo para ilustrar o efeito do tratamento com drogas em 3D esferóides NET. Figura mostra a morfologia dos esferóides 3D sobre o tratamento de TSA Figura. 3B mostra o volume dos esferóides 3D sobre TSA (Sigma, T8552) de tratamento. O tamanho de cada indivíduo foi estimada esferóide automaticamente por um custom-desenvolvido MATLAB programa de computador. 4 Um passo de desenho manual foi adicionada para ajudar a obter os esferóides, que eram muito perto da extremidade de uma dada imagem. Pelo menos 8 esferóides foram medidos por dose de tratamentos de TSA em cada ponto de tempo. O volume de cada esferóide 3D ​​foi calculada como 0,5 x Comprimento x Largura 2. Como visto na Figura 3A e 3B, em relação ao veículo, todas as doses de TSA mostrados nas figuras demonstrado algum grau de inibição do crescimento de Bon-1 esferóides 3D. Entre eles, as concentrações de 125 nM e 250 nM de TSA fortemente reprimida o crescimento de esferóides 3D e levou à morte celular em 96-hr ponto de tempo. Para compreender a histologia dos esferóides NET 3D, um H e E e coloração (IHC) imuno-histoquímica foram realizados em esferóides 3D que tinha sido cultivadas durante 17 dias. Figura 4A ilustra um método para processar esferóides 3D para incorporação HistoGel, que é a chave passo para inclusão em parafina de 3D spher<html> oids. A Figura 4B mostra a coloração HE, a coloração imuno-histoquímica da clivados caspase-3 (um marcador de células apoptóticas) e Ki-67 (um marcador para a proliferação de células) em anticorpos esferóides 3D, que tinha sido cultivadas durante 17 dias . As células no interior do núcleo dos esferóides 3D são na maior parte necrótica / apoptótico e as células da camada exterior são activamente a proliferar. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. A morfologia de NET Esferóides 3D. Os esferóides 3D a partir de três linhas de células humanas de tumor neuroendócrinos são formados em agarose revestidas placas de 24 poços. 1.000 células BON-1, H727 e QGP-1 foram semeados em agarose revestidas placas de 24 poços e cultivadas em uma condição fisiológica normal, conforme detalhado no protocolo. Estas são as imagens de esferóides 3D para BON-1 e H727 ou célula agregados para QGP-1, que foram cultivadas durante 10 dias. 18/4218fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. O Tracking Crescimento de BON-1 Esferóides 3D O rastreamento crescimento de esferóides Bon-3D: 1. Crescimento, formação e desintegração de esferóides 3D. Como detalhado no protocolo, 1,000 Bon-1 células são plaqueadas em um agarose revestido placa de 24 cavidades. As células são cultivadas num meio DMEM/F12 padrão com FBS a 10% sobre um agitador orbital em uma condição fisiológica durante a noite, em seguida, mudou-se sobre uma plataforma estável e cultivadas nas mesmas condições. O crescimento das células de rastreamento 3D foram seguidos por células de imagem a cada hora para o primeiro 5 horas após o plaqueamento, e depois a cada 1-3 dias com uma Axiovert Zeiss 200/M-based de contraste de fase utilizando um microscópio de objetiva de 5x. As células agregadas em massas em primeiro lugar, em seguida, formar agregados multicelulares, esferóides pequenos, esferóides maiores e, eventualmente, os esferóides se desintegram. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. TSA Tratamento de BON-1Esferóides 3D. (A) Imagens de esferóides 3D sobre tratamento TSA. Tratamento grupo: V - Veículo (0,0025% DMSO); D1 dose-1 (15,625 nM TSA); dose-D2 2 (31,25 nM TSA); D3: dose 3 (62,5 nM TSA); D4: dose de 4 (125 nM TSA ); D5: dose de 5 (250 nM TSA). Tempo de tratamento: 0 H - ponto de tempo que os tratamentos iniciados no dia 6 esferóides 3D; 24 h, 48 h, 72 he 96 e H são os pontos de tempo após os tratamentos iniciado. Esferóides 3D foram visualizados em cada ponto de tempo como antes. (B) Crescimento dos esferóides 3D após tratamento TSA. Os principais (L) e menores (W) eixos dos esferóides 3D em (A) foram estimados automaticamente pelo programa Matlab em cada ponto de tempo de tratamentos (0, 24, 48, 72 e 96 h). O volume dos esferóides 3D foi estimada como sendo 0,5 x L x W 2. O volume do esferóide no gráfico foi a média de 8 repetições e da barra de erro foi estimada com base na 8 repetições. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" /> Tabela 1.Disposição dos tratamentos com drogas sobre uma placa de 24 poços <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="A Figura 4A" /> A Figura 4A. Ilustração de um método para processar Esferóides 3D para Embedding HistoGel. Um método para processar esferóides 3D para incorporação HistoGel e coloração imuno-histoquímica dos esferóides 3D (A) Uma visão geral de um método para processar esferóides 3D para a incorporação HistoGel. Esferóides 3D foram encapsuladas em um HistoGel de estar no mesmo nível no cryomold biópsia, em seguida, o HistoGel / bloco esferóides foi embrulhado num azul Bio-envoltórios e transferida para uma cassete de biópsia amarelo para inclusão em parafina. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="A Figura 4B" /> Figura 4B. H &amp; E Coloração e coloração imuno-histoquímica do dia 17 Esferóides 3D. (B) coloração H &amp; E, coloração imuno-histoquímica de Ki-67 e Clivadas Caspase-3 dos esferóides 17-dia em 3D. O paraffin-incorporados lâminas seccionados foram desparafinizados e recuperação antigênica foi realizada utilizando CCI (solução de células condicionado, Verana Medical System, # 711-065-152). Anticorpo policlonal de coelho Ki-67 de anticorpos (Abcam. # Ab833) e clivado Caspase 3 anticorpo (Cell Signaling Technology, # 9661) foram aplicados a uma concentração de 1:75 e 1:200, respectivamente, durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo secundário anti-coelho (Jackson Immunolab, # 711-065-152) foi aplicado a 1:500 durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por detecção cromogénico kit DABMap (Ventana Medicai Systems, # 760-124). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina e desidratados e limpo antes de lamínulas de xileno.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós demonstramos um método simples, confiável e reprodutível para formar esferóide multicelular 3D a partir de células tumorais humanas neuroendócrinos utilizando agarose revestidas placas de 24 poços. O sucesso desta técnica é a capacidade de obter um esferóide único com tamanho homogéneo e forma uniforme por dia 6 a partir de um número fixo de células. O passo chave é a agitação lenta da placa com células líquidas para o primeiro hr 16-24 após o plaqueamento. Este método pode também se aplicam ao comum humano da mama linha de células MCF-7, do cólon humano linha celular de adenocarcinoma HT-29, humano de células não pequenas do pulmão linha de células de carcinoma H1299 e linha celular de rim embrionário humano HEK-293. Todos eles podem formar uniformes e compacto esferóides 3D para tela de droga terapêutico (dados não mostrados). Embora vários métodos são relatados na geração de esferóides 3D, 7-10 método aqui relatados não requer placas especializadas ou reagentes e é, portanto, simples e rentável. Nosso demonstrando dados inéditose que a NET esferóides 3D cultivadas em agarose imitar o tumor in vivo xenoenxerto NET geometricamente e molecularmente, quando comparadas com as células em monocamada 2D. Isto é semelhante ao que foi reportado para os esferóides 3D feitos a partir de sobre outras linhas de células de cancro humano. 11,12 limitação do modelo 3D de cultura de células é que ele não pode substituir completamente testar a eficácia in vivo de quaisquer medicamentos ou tratamentos terapêuticos porque os esferóides 3D são como tumores avasculares, que é diferente do de tumor in vivo neste aspecto. No entanto, este método ajudará a ponte e as avaliações da NET drogas terapêuticas a partir de, in vitro, in vivo em alguns aspectos. Coloração de imunofluorescência em esferóides multicelulares é muito difícil de realizar, devido ao grande tamanho e geometria dos esferóides flutuantes 3D e à limitação do microscópio confocal. Aqui temos ilustrar um método para processar a incorporação HistoGel para parafinaincorporação, permitindo coloração imuno-histoquímica das lâminas de série seccionados dos esferóides 3D. Além disso, o nosso costume desenvolvida programa MATLAB ajuda de forma precisa e reprodutível estimar o tamanho dos esferóides, monitorar a eficácia da droga de forma eficiente, e poderia ser incorporada uma tela de alto rendimento para o desenvolvimento de medicamentos para os pacientes NET.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Mídia </td><td> Gibco </td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE </td><td> Gibco </td><td> 12604 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> Falcão </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 70 filtro de célula mM </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td> Fita de vedação estéril </td><td> Nunc </td><td> 236366 </td><td></td></tr><tr><td> Tricostatina A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy

Os tumores neuroendócrinos (TNE) são tumores raros, com incidência de dois por 100, 000 pessoas por ano, e são responsáveis ​​por 0,5% de todos os tumores humanos. 1, com excepção da cirurgia para a minoria dos pacientes que apresentam doença localizada, há benefício de sobrevivência pouco ou nenhum tratamento sistêmico. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de uma melhor compreensão da biologia de redes, e em particular definir novos alvos terapêuticos para pacientes com tumores não operáveis ​​ou metastático neuroendócrinos. Cultura de células em 3D está se tornando um método popular para a triagem de drogas devido à sua relevância na modelagem da organização no tecido vivo do tumor e microambiente. 2,3 Os esferóides 3D multicelulares podem fornecer informações valiosas de forma mais rápida e menos dispendiosa do que directamente provenientes de 2D experimentos de cultura de células de animais (camundongos) modelos. Para facilitar a descoberta de novas terapêuticas para pat NETients, desenvolvemos um modelo in vitro esferóides 3D multicelular utilizando as linhas de células humanas NET. As células são plaqueadas NET de uma forma não-adesiva de agarose-revestido placa de 24 cavidades e incubadas sob condições fisiológicas (5% de CO 2, 37 ° C) com uma agitação muito lenta para 16-24 horas após o plaqueamento. As células formam esferóides multicelulares a partir do dia ª 3 ª ou 4. Os esferóides tornar-se mais esférica pelo dia 6 th, ponto em que os tratamentos com drogas são iniciadas. A eficácia dos tratamentos com drogas sobre os esferóides NET é monitorizado com base na morfologia, forma e tamanho dos esferóides com um microscópio de luz de contraste de fase. O tamanho dos esferóides é estimado automaticamente usando um programa desenvolvido personalizado MATLAB baseado num algoritmo contorno activo. Além disso, demonstramos um método simples para processar a incorporação HistoGel sobre estes esferóides 3D, permitindo a utilização de técnicas padrão de histológicas e imuno-histoquímica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Este é o primeiro relatório sobre a geração de esferóides 3D usando linhas celulares NET para examinar o efeito de drogas terapêuticas. Realizou-se também histologia sobre estes esferóides 3D, e exibido um exemplo de efeito de uma única droga sobre o crescimento e proliferação dos esferóides NET. Nossos resultados confirmam que os esferóides NET são valiosas para futuros estudos de biologia NET e desenvolvimento de medicamentos.

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Nós apresentamos uma simples sobreposição de agarose plataforma para crescer 3D esferóides multicelulares utilizando linhas celulares de cancro neuroendócrino. Este método oferece uma maneira muito conveniente para examinar o efeito de drogas terapêuticas sobre as células tumorais neuroendócrinos. Também poderia ajudar-nos a estabelecer humanos esferóides tumor neuroendócrino para terapia de câncer.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

28.5K visualizações.  Raymond and Beverly Sackler Foundation. Nós apresentamos uma simples sobreposição de agarose plataforma para crescer 3D esferóides multicelulares utilizando linhas celulares de cancro neuroendócrino. Este método oferece uma maneira muito conveniente para examinar o efeito de drogas terapêuticas sobre as células tumorais neuroendócrinos. Também poderia ajudar-nos a estabelecer humanos esferóides tumor neuroendócrino para terapia de câncer.

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A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Medicina

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable risks for normal tissue injury and the hazards of physical tumor miss. A first-of-its-kind SBRT platform achieves high-precision ablative radiation treatment through a combination of versatile real-time imaging solutions and sophisticated tumor tracking capabilities. It uses dual-diagnostic kV x-ray units for stereoscopic open-loop feedback of cancer target intrafraction movement occurring as a consequence of respiratory motions and heartbeat. Image-guided feedback drives a gimbaled radiation accelerator (maximum 15 x 15 cm field size) capable of real-time &#177;4 cm pan-and-tilt action. Robot-driven &#177;60&#176; pivots of an integrated &#177;185&#176; rotational gantry allow for coplanar and non-coplanar accelerator beam set-up angles, ultimately permitting unique treatment degrees of freedom. State-of-the-art software aids real-time six dimensional positioning, ensuring irradiation of cancer targets with sub-millimeter accuracy (0.4 mm at isocenter). Use of these features enables treating physicians to steer radiation dose to cancer tumor targets while simultaneously reducing radiation dose to normal tissues. By adding respiration correlated computed tomography (CT) and 2-[18F] fluoro-2-deoxy-&#7429;-glucose (18F-FDG) positron emission tomography (PET) images into the planning system for enhanced tumor target contouring, the likelihood of physical tumor miss becomes substantially less1. In this article, we describe new radiation plans for the treatment of moving lung tumors.

Stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) involves the precise delivery of high-dose radiation to cancer tumor targets. A novel SBRT platform offers a first-of-its-kind gimbaled radiation accelerator mounted within a pivoting O-ring gantry capable of dynamic image-guided tumor tracking. Here, we describe dynamic tumor tracking for lung targets.

Rastreamento Dinâmico Tumor do pulmão por estereotáxica ablativo Radioterapia do corpo

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...