Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Gongpu Zhao e Danxia Ke para suporte técnico. Agradecemos a drs. Edward Egelman e Niko Grigorieff para compartilhamento de seus softwares de processamento de imagem. Reconhecemos também o pessoal de apoio da Biologia Estrutural Cryo-EM facilidade e Beowulf cluster e grade da Universidade de Pittsburgh School of Medicine. Este trabalho foi financiado pela GM082251 e GM085043.

1. Frozen-hidratado preparação de amostras EM Porque o HIV-1 proteína capsídeo (CA) 9 assembléias são estáveis ​​apenas no sal de alta (1M NaCl) buffer, o que contribui o ruído de fundo forte em crio-EM imagens, usamos uma diluição rápida e verso-blotting método para reduzir temporariamente o sal concentração na preparação do frozen-hidratado grade EM. <ol><li> Descarga luminescente lado de carbono de 200 mesh-R2 / 1 grades de cobre Quantifoil sob 25mA por 25 segundos. </li><li> Use um nebulizador para trazer a umidade na câmara ambiental, um home-made êmbolo gravidade manual, para 80%. </li><li> Na FEI Vitrobot Plunger dewar, etano líquido frio usando nitrogênio líquido. Monte o dewar mergulhar congelamento sobre o êmbolo gravidade manual. </li><li> Aplicar 2,5 mL de solução preassembled CA para o lado de carbono da grade, que é montada em uma pinça, e coloque a pinça para o êmbolo com o lado de carbono da grade de frente para longe de você. </li><li> Adicionar 3 mL de tampão de diluição baixa em sal (100 mM NaCl) para a parte de trás da grade e imediatamente blot a parte de trás da grade com um pedaço de papel de filtro. A superfície de volta toda a grade deve estar em estreito contacto com o papel de filtro para cerca de 6 segundos, antes de remover o papel de filtro. Imediatamente mergulhar a grade em etano líquido após a remoção do papel de filtro. </li><li> Remova a pinça do êmbolo e rápida de transferir a grade em uma caixa de armazenamento de rede. </li></ol> 2. Cryo-microscopia eletrônica de CA tubular assembléias <ol><li> Carregar a grade de frozen-hidratado em um G2 Polara FEI operacional microscópio eletrônico de 200KV e equipado com uma câmera CCD Gatan 4Kx4K. </li><li> No modo de baixa dosagem de busca, com uma ampliação de 200x ~ e com uma dose &lt;0.001e - / A 2, tela de toda a rede para áreas com gelo adequado e salvar as posições destas áreas em um arquivo de palco. </li><li> Lembre-se das posições salvo e tela ainda mais estas áreas com uma ampliação de 3.900 x no modo de baixa dosagem de busca. Selecionar as áreas com uma camada uniforme e fina de gelo que contém bem separados, tubos longos sobre buracos, para coleta de dados. Guardar os locais dessas áreas em um arquivo de segundo estágio. </li><li> Mude para o modo de exposição com uma ampliação de 59.000 x, inset a 100 mM Abertura da objectiva, e ajustar a estigmatização objetivo e intensidade do feixe para uma dose de ~ 15 e - / Å 2 por exposição. </li><li> Retornar ao modo de baixa dose de busca, mover para uma posição salva e identificar e centro de um tubo bom usar a câmera CCD. Mude para o modo de foco, ajustar o foco, e definir um valor defocus, normalmente entre 0,5-2,5 mM. Mude para o modo de exposição, definir um tempo de exposição de 0,3-0,5 segundos, para uma dose de 15 e - / a 2, e recolher uma imagem. As imagens são coletadas em uma câmera de placa, e os filmes devem ser autorizados a se contentar com 10 segundos antes de uma exposição é tomada. </li><li> Mover para a próxima posição salvos e repita o passo 5 para coletar mais imagens. </li><li> Os filmes são desenvolvidos com toda a força D19 por 12 minutos e digitalizados usando uma Nikon SUPER COOLSCAN 9000 ED scanner em um tamanho de pixel de 6,35 mM. O formato de arquivos de imagem TIFF é. </li></ol> 3. Indexação helicoidais Um objeto helicoidais podem ser indexados por dois parâmetros: a ordem Bessel, n, eo número de camada de linha, l. Cada linha da camada na transformada de Fourier, como caracterizado por (n, l), corresponde a um conjunto de linhas na rede superfície do objeto helicoidais denotada por (h, k) índices, usando a notação de uma treliça 2D. Para qualquer (h, k), uma linha de camada (n hk, l hk) é uma combinação linear de dois vetores básicos (n 10, l 10) e (n 01, l 01), que são os valores n e l de as duas linhas camada principal (1, 0) e (0, 1). l pode ser obtida a partir da altura da linha da camada medida ao longo do eixo Z na transformada de Fourier. O valor de n pode ser estimado usando a seguinte equação 10 πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1) onde J n é a função Bessel, que determina a intensidade da linha da camada n ª, r é o raio do objeto helicoidal, e R é o raio da amplitude máxima da linha da camada. O número da linha da camada, l, está relacionado com n pela regra de seleção 11 l = tn + hum ....................( 2) onde t e u são constantes da hélice. Para qualquer hélice dado, pode haver unidades exatamente u exatamente (ou muito perto) t complete voltas. <ol><li> Caixa de um tubo relativamente simples e longo com diâmetro uniforme usando o REMA do programa de 12 helixboxer e salvar a imagem em formato MRC. </li><li> Determinar a distância de repetição helicoidal, c, usando um programa de correlação cruzada baseada, como &#39;imgccf&#39;, no pacote de MRC 13. </li><li> Calcule a transformada de Fourier com um comprimento nova caixa que é parte integrante da distância repetir, c. </li><li> Escolha duas linhas principais que definem camada de dois vetores de superfície básica treliça (1,0) e (0,1). </li><li> Medir o raio do tubo, r, ea altura e raio da camada de duas linhas principais de transformada de Fourier, l 10, R 10, l 01 R 01, respectivamente (Fig. 1). </li><li> Calcular n 10 e n 01 de acordo com a equação (1). </li><li> Uma vez que os valores n são apenas estimativas, algumas combinações de n 10 e 01 n são testados em etapas posteriores (Veja o passo 4.2) para encontrar a simetria helicoidal correto usando o IHRSR pacote do programa. </li><li> Calcular a simetria parafuso descrito por dois números reais: a rotação entre as subunidades (Δφ) ea ascensão axial (Δz) da hélice de uma estrela (n = 1). Dado l 10, l 01, n 10, e n 01 valores, u e t podem ser obtidos pelo teste de uma faixa de valores m (por exemplo, -50 &lt;m &lt;50) de acordo com a regra de seleção. Finalmente, Δφ e Δz são calculados usando Δφ = 360 t / u e Δz = c / u. </li></ol> 4. Reconstrução tridimensional <ol><li> Segmentação de partículas <ol><li> Abra uma micrografia contendo partículas helicoidais, usando o Boxer programa gráfico, que é um programa no pacote REMA. </li><li> Cortar a partícula em segmentos helicoidais sobrepostas. No painel de controle do Boxer, escolher o modo de Helix e definir os parâmetros para o boxe: o tamanho da caixa deve ser maior que o diâmetro da partícula eo valor para &#39;Olap&#39; deve ser ~ 90% do tamanho da caixa. </li><li> Depois de esquerda clicando em uma das extremidades da partícula helicoidal, Boxer irá gerar automaticamente uma série de caixas de partículas ao longo do comprimento da hélice. </li><li> Salvar os segmentos em caixa, bem como suas coordenadas. </li></ol></li><li> Reconstrução 3D inicial usando programas IHRSR <ol><li> Inverter o contraste das imagens Cryo-EM e aplicar filtragem passa-baixa 14 (opcional) antes do processamento com o método de reconstrução iterativa helicoidal espaço real (IHRSR). </li><li> Abrir a interface gráfica do programa IHRSR digitando &quot;Generator&quot;. Proporcionar a interface gráfica com todas as informações para a pilha de partículas em caixa, incluindo o nome eo caminho da pilha, número de imagens na pilha, os valores para os parâmetros de simetria, etc Clique no botão &quot;Finish&quot; para criar o script de reconstrução, b25.spi. </li><li> Use um cilindro sólido ou oco como uma referência inicial e permitir que o procedimento para o ciclo até que não haja mudanças na simetria parafuso definida, o que geralmente ocorre após alguns ciclos. A simetria helicoidal direito deve dar a uma reconstrução convergentes de forma estável. A reconstrução gerado no último ciclo será usado como uma referência inicial para aperfeiçoamento. IHRSR executa programas de reconstrução em 3D usando o SPIDER. </li></ol></li><li> Reconstrução com refinamento iterativo 15 A reconstrução 3D gerados por IHRSR é agora utilizada como uma referência inicial para o refinamento adicional. Durante o refinamento, a simetria helicoidal é fixado em Δφ e Δz, que são determinados a partir do procedimento IHRSR. <ol><li> Determinar a desfocagem e apresentar astigmatismo na micrografia usando programas CTFFIND3 e CTFTILT 16. </li><li> Multiplicar os segmentos de partículas pela CTF usando programas SPIDER 17. A operação denominada FT na suíte SPIDER é usado para calcular a transformada de Fourier (FFT) da imagem 2D. Posteriormente, a FFT é multiplicado por valores CTF, apurado nas etapas anteriores, usando a operação denominada MU dentro do conjunto SPIDER. O valor obtido é então transformada inversa de volta para formar uma nova imagem (CTF-corrigida) no espaço real, utilizando a operação SPIDER, FT novamente. </li><li> Realizar com a projeção, comparando as projeções dos volumes de referência com o CTF corrigida imagens, usando multi-referência de alinhamento. A variação no ângulo de inclinação fora do plano é limitado a + / -10 ° e amostrados em passos de 1 °. Introduzir restrições, tais como altos coeficientes de correlação, no plano ângulos perto de 0 ° ou 180 °, e limitado x turnos, para os parâmetros de alinhamento de cada segmento. Incluir na reconstrução apenas os segmentos que satisfazer as restrições. </li><li> Depois de cada ciclo iterativo de refinamento, uma reconstrução 3D é gerado usando a projeção para trás e dividido pela soma sobre o CTF2. </li><li> Impor a simetria helicoidal para gerar um volume simetrizada. O refinamento iterativo é encerrado quando não há melhoria na resolução da reconstrução 3D novo ocorre. </li><li> A imagem SPIDER pacote de processamento é utilizado para a maioria das etapas de refinamento. Uma série de operações são controladas por scripts SPIDER, que são arquivos criados pelo usuário controlo de lotes contendo seqüências de operações e valores dos parâmetros. A reconstrução final é calculado usando programas em SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Resultados representativos: A única HIV-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) estava fora encaixotado e sua transformada de Fourier (Figura 1b) foi calculado para indexação helicoidal. Para as linhas de nível (1, 0) e (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Dado um tubo de raio 211.57Å, nós aproximada n 10 =- 12, n 01 = 11 (aqui, a lateralidade foi pré-determinado). Com uma distância de repetição do 5195.48Å, a simetria do parafuso do tubo foi determinada como Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz e Δφ foram refinados para 7.1321Å e 328,86 ° usando IHRSR (Fig. 2a) ea reconstrução inicial é mostrado na figura. 2b. A reconstrução final (Fig. 3), depois de refinamento iterativo, melhorou o mapa de densidade significativamente a partir do modelo inicial calculado com IHRSR (Fig. 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Indexação de HIV-1 tubo helicoidal CA. (A) A única HIV-1 CA tubo de imagem A92E. Barra de escala, 30 nm. (B) A transformada de Fourier do tubo mostrado em (A). Os índices helicoidal (n 10 =- 12, n 01 = 11) são indicadas. A seta aponta para a linha de camada em resolução 23A. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Uma reconstrução inicial usando IHRSR. (A) determinação simetria Parafuso para cada ciclo iterativo. Δφ e Δz, a partir dos valores iniciais, convergem para os valores estáveis ​​após 10 ciclos iterativos requinte. (B) O mapa de densidade inicial em 3D depois de 10 ciclos iterativos. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. O mapa de densidade 3D após a refinamento iterativo. (AC) O mapa de densidade de CA tubos é exibido como três fatias ortogonais: paralela ao eixo do tubo e próximo à superfície (A), perpendicular ao eixo do tubo (B), e em paralelo e através do eixo do tubo (C) . Barras de escala, 10 nm. (D) a prestação de superfície do mapa de densidade de contorno 3D em 1.8S colocando 100% em volume.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos um conjunto de protocolos para fornecer uma abordagem simples para obtenção de estruturas 3D de objetos helicoidal. Utilizando os procedimentos descritos, nós adquirimos uma estrutura 3D do HIV-1 montagem do capsídeo de um único tubo de imagem (176 segmentos). Estruturas de alta resolução pode ser alcançado através da inclusão de mais dados de imagem. Existem vários pontos críticos para a coleta de dados e análise ideal: primeiro, durante a preparação de uma amostra de crio-EM, a solução da amostra devem ser apagados, deixando uma camada fina e uniforme de solução que é ligeiramente mais espessa do que o tamanho da amostra. Existem várias maneiras diferentes para apagar a amostra. Para bactérias e células de amostras tubular, tais como HIV-1 CA montagem, mata-borrão de um lado, particularmente na parte de trás lado, é mais adequado. Segundo, a lateralidade da hélice precisa ser determinado, como esta não pode ser feito por indexação helicoidal ou reconstrução. Uma prática comum é usar freeze-ataque, seguido pelo rotary shadowing 18 para determinar a lateralidade. Destreza manual também pode ser determinado pós-reconstrução quando a resolução do mapa de densidade é suficientemente elevada; os modelos 3D atômico de componentes individuais devem se encaixar bem no mapa de densidade quando um handedness correta é assumida. Caso contrário, a lateralidade oposto deve ser assumida. Terceiro, um filtro de Wiener deve ser usado durante o processamento de imagem, tanto para fase e correção de amplitude, para reduzir a amplificação de ruído. Desde o CTF de uma única imagem sempre tem cruzamentos de zero, parte da informação no espaço recíproco é perdido. Portanto, é necessário dispor de dados de projeção vários conjuntos incluídos para reconstrução 3D, cada um com imagens em valores defocus diferente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Fonte </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Dispositivo de descarga luminescente 100X </td><td> Dispositivo de descarga luminescente 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscópio com Field Emission Gun </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> 4K x 4K Gatan câmera CCD </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Mergulhe congelamento de dispositivo </td><td></td><td> Home-made êmbolo manual de gravidade </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh grades holely carbono-cobre </td><td> Quantifoil Micro Ferramentas, Jena, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> EM software REMA </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programas disponíveis a partir de Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM software Aranha </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC baseado em software de processamento de helicoidais </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programas disponíveis a partir de Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT e Real-espaço software refinamento helicoidais </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

Cryo-microscopia eletrônica (Cryo-EM), combinado com processamento de imagem, é uma ferramenta cada vez mais poderosos para a determinação da estrutura de complexos macromoleculares de proteínas e montagens. Na verdade, microscopia eletrônica única partícula 1 e bidimensional (2D) de elétrons cristalografia de dois tornaram-se relativamente metodologias de rotina e um grande número de estruturas foram resolvidos com estes métodos. Ao mesmo tempo, processamento de imagem e reconstrução tridimensional (3D) de objetos helicoidal tem se desenvolvido rapidamente, especialmente, a iterativa helicoidal espaço real de reconstrução do método (IHRSR) 3, que utiliza ferramentas de análise única partícula em conjunto com simetria helicoidal. Muitas entidades biológicas função em formas filamentosas ou helicoidais, incluindo filamentos de actina 4, 5 microtúbulos, fibras amilóides 6, vírus do mosaico do tabaco 7, 8 e flagelos de bactérias, e, por um mapa de densidade 3D ​​de uma entidade helicoidal pode ser alcançado a partir de uma única projeção imagem, em comparação com as imagens muitas necessários para a reconstrução 3D de um objeto não-helicoidal, com o método IHRSR, análise estrutural de tais flexível e desordenada assembléias helicoidais agora é atingível. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos protocolos detalhados para a obtenção de um mapa 3D da densidade de um conjunto de proteínas helicoidal (HIV-1 capsídeo 9 é nosso exemplo), incluindo protocolos para crio-EM preparação de amostras, uma dose baixa de coleta de dados por Cryo-EM, a indexação de padrões de difração helicoidal, e processamento de imagem e reconstrução 3D usando IHRSR. Em comparação com outras técnicas, crio-preservação EM oferece espécime ideal sob condições quase nativo. Amostras são incorporados em uma fina camada de gelo vítreo, por congelação rápida, e com imagens em microscópios de elétrons à temperatura de nitrogênio líquido, sob condições de baixas doses para minimizar os danos da radiação. Imagens da amostra são obtidas sob condições quase nativo à custa de sinal baixo e de baixo contraste nas micrografias registradas. Felizmente, o processo de reconstrução helicoidal tem sido amplamente automatizado, com exceção de indexar o padrão de difração helicoidal. Aqui, descrevemos uma abordagem para indexar estrutura helicoidal e determinar simetrias helicoidal (parâmetros helicoidais) de micrografias digitalizadas, um passo essencial para a reconstrução 3D helicoidal. Brevemente, obtemos um mapa de densidade inicial de 3D, aplicando o método IHRSR. Este mapa inicial é, então, iterativamente refinados através da introdução de restrições para os parâmetros de alinhamento de cada segmento, assim, controlar os seus graus de liberdade. Aperfeiçoamento é alcançado através da correcção para a função de transferência de contraste (CTF) do microscópio eletrônico (correção de amplitude e fase) e, otimizando a simetria helicoidal da assembléia.

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Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Este artigo descreve um método para obter uma estrutura tridimensional (3D) das moléculas helicoidalmente montados usando crio-microscopia eletrônica. Neste protocolo, usamos assembléias HIV-1 capsídeo para ilustrar o processo de reconstrução 3D detalhados para alcançar um mapa de densidade pelo método de reconstrução iterativa helicoidais real-espaço.

Estrutura do HIV-1 Assembléias Cápside por Cryo-Microscopia eletrônica e reconstrução iterativa helicoidal espaço-Real

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. Este artigo descreve um método para obter uma estrutura tridimensional (3D) das moléculas helicoidalmente montados usando crio-microscopia eletrônica. Neste protocolo, usamos assembléias HIV-1 capsídeo para ilustrar o processo de reconstrução 3D detalhados para alcançar um mapa de densidade pelo método de reconstrução iterativa helicoidais real-espaço.

Vídeo: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Imunologia e Infecção

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Microondas Assistida Diagnóstico Rápido de Doenças vírus de planta por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...