Damos graças especiais para Lino Kim, Steve Guzman e Satyarthi Ujit de assistência técnica durante o desenvolvimento deste método. Myron Hawthorne, Richard Spengel, e Roberto Rojas usinado as câmaras usadas aqui e desde muito necessária assistência técnica. Notavelmente, Roberto Rojas produzido Figura 4. Estamos também gratos conselhos inestimáveis ​​Scott Fraser antes do desenvolvimento do ensaio de quimiotaxia acima. Este trabalho foi parcialmente financiado por um SCORE-5S06GM048680-13 NIH-MBRS para Medb e por um prêmio do, Northridge CSU de Pós-Graduação Programa de Apoio à Tese de CW.

1. Dia 1: O isolamento de tubos de tronco neurais para a cultura durante a noite em lamelas <ol><li> Incubar os ovos de pintainho para 56 h a 38 ° C. Retirar os ovos de incubação, levemente pulverizá-los com etanol a 70%, e, em seguida, permitir que sequem. Quebre os ovos abertos em uma bandeja de vidro UV-esterilizado. </li><li> Extraia cada embrião a partir da sua gema e colocá-lo no pinto de Ringer. Faça isso primeiro corte em torno de suas ilhas de sangue com tesoura curva, em seguida, com uma pinça sem corte, escolher o embrião por sua membrana extraembryonic e colocá-lo em uma placa de Petri estéril plástico contendo solução de Ringer garota. </li><li> Isolar o tronco de cada embrião por aparando o excesso de membranas extra-embrionário, bem como cranianos, vagal, e sacral níveis axiais, utilizando uma agulha de tungsténio (Fig. 1). Primeiro, selecione cerca de 9 embriões que estão entre os estágios HH15-17 11. Para fases HH15 e para cima, os eixos do prosencéfalo e rombencéfalo formar um ângulo agudo e, por conseguinte, a cabeça parece inclinar caudalmente. Emestágio HH17, o broto da cauda está presente e inclina ventralmente mas ainda não conter somitos. Com uma agulha de tungstênio, corte Membranas Extra-Embrionárias para cerca de 2 mm a partir do embrião e cortar todos os tecidos embrionários anteriores a somito 10. Também remover todos os tecidos embrionários a partir de caudais em torno do quinto somito mais recentemente formado. </li><li> Colocar os troncos isolados embrionárias em Dispase (0,24 U / ml de DMEM) e incubar durante 1 h 15 min a 37 ° C e 5% CO 2. Uma vez que os troncos de começar a incubação, começar a preparar 6 lamelas (CS) para explantes NT (passos 1,5-1,8). </li><li> Enxaguar 6 CS em etanol a 70% (diluído em água, estéril ultrapura), e, em seguida, permitir que sequem. Usando um marcador de laboratório, desenhar um círculo no centro de cada CS que é de cerca de 1 cm de diâmetro (este círculo, mais tarde, ajudá-lo a identificar onde um casaco de fibronectina foi aplicada). Na mesma face de cada CS, escrever a palavra &quot;ser&quot; (ou alguma outra palavra assimétrico ou forma) fora do círculo desenhado (isso vai ajudá-yOU identificar se o lado marcado do CS está voltada para cima ou para baixo). </li><li> Colocar cada CS em um 40 x 10 mm separado prato esterilizado com a superfície marcada voltada para baixo e permitir que o prato de sentar aberto por baixo de uma lâmpada de UV germicida, durante 10 min. </li><li> Aplicar 60 ul a fibronectina (FN, 10 ug / ml de DMEM) para a superfície não marcada do CS assegurando ao mesmo tempo toda a área dentro do círculo de 1 cm é revestido. Colocar as placas a incubar a 37 ° C durante 30 min e, em seguida, cuidadosamente aspirado a partir de cada fibronectina CS. </li><li> Adicionar 250 ul de &quot;cultura&quot; medium [DMEM com L-glutamina (2 mM), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100 mcg / ml), e 8% de soro fetal bovino (FBS)] à área de FN revestido o CS. Colocar as cápsulas contendo cada CS a 37 ° C e 5% CO 2, até que os NTs têm sido isolados. </li><li> Transferir todos os troncos de embriões incubados a um centímetro de vidro de 5 placa de Petri contendo meio L15 e começar dissecando cada NT utilizando uma pinça fina e uma agulha de tungsténio (Fig. 1). Carefully cortar ao longo da fronteira do NT e somitos com uma agulha de tungstênio afiada ao ser cauteloso para não danificar o NT. Muitas vezes, é mais fácil começar isolando cada NT a partir do final caudal-a maior parte do tronco. </li><li> Selecione 6 dos NTs retas longas e para a cultura durante a noite (NTs entre cerca de 8 e 15 somitos prazo é recomendado). Utilizando uma ponta de micropipeta preparado com meio de cultura, transferir cada um dos 6 NTs ao seu próprio CS previamente preparado (a partir de 1,5 por meio de etapas de 1,8). Certifique-se de que o NT não permanece flutuando na superfície. Se o NT é flutuante, gotejamento meio para ele até que ele afunda usando uma micropipeta. </li><li> Colocar cada prato a 37 ° C e 5% CO 2 durante a noite. Ter cuidado para assegurar que cada NT está dentro da área de FN revestido da sua respectiva CS imediatamente antes de se colocar o prato na incubadora (usando o círculo desenhado no passo 1.5 como uma referência). A micropipeta pode ser usado para ajustar melhor a posição de cada NT, se necessário. </li><li> Lugar nopelo menos 2 ml de meio de cultura (sem soro) para um tubo de centrífuga estéril de 15 ml e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. Deixe a tampa ligeiramente desenroscada para permitir que o pH do meio de ajustar a noite. Pré-incubar o meio é importante para ajudar a prevenir a formação de bolhas na sua câmara, o que pode perturbar o estabelecimento de um gradiente molecular. Tal meio de &quot;pré-incubadas&quot; deve ser utilizado em todas as etapas futuras. Quando não está a ser utilizada, esta deve ser meio de incubação a 37 ° C. </li></ol> 2. Dia 2: Carregamento da câmara modificado Zigmond e lapso de tempo de análise da migração celular <ol><li> Dos 6 NTs cultivadas, selecione as três culturas mais adequadas para análise. Em geral, as culturas de NCC que têm pelo menos uma aresta longa, linear deve ser seleccionado (Fig. 2A). Os 3 melhores culturas irão ser usados ​​para carregar e filme 3 câmaras modificados Zigmond ao longo do dia, cada uma com um tratamento diferente. Fora das três culturas, escolher um para loading câmara o primeiro e retornar os outros para a incubadora para uso posterior. </li><li> Usando um cotonete, aplique uma camada fina e uniforme de vaselina ao redor dos reservatórios e pontes de uma modificação Zigmond câmara. </li><li> Com uma agulha de tungsténio, retire o NT do CS, enquanto deixa os CBCs circundantes que aderem à superfície do CS. Marcar o recipiente com uma caneta para lembrar a orientação da reta borda da cultura NCC. </li><li> Coloque algumas gotas de meio de pré-incubado na ponte. Pegar o CS com uma pinça fina, dab a borda do CS contra um Kimwipe para remover a maior parte do meio de cultura anterior, então colocar imediatamente o CS na câmara Zigmond modificado de modo que a vara de a cultura a ser filmado está centrada sobre o comprimento da ponte e aproximadamente perpendicular à borda ponte reservatório (Fig. 2A, B). </li><li> Utilizando um microscópio invertido, mova a borda NCC directamente para estar no lado da ponte mais próxima threservatório e que irá conter o chemotactant suspeita (Fig. 2B; para controles isto irá corresponder a qualquer reservatório é carregado segundo). Além disso, mais finamente alinhar a vara da cultura a ser perpendicular à borda ponte reservatório. </li><li> Cuidadosamente, mas firmemente apertar o CS em vaselina líquida presente na câmara Zigmond, certificando-se que seja completamente selada para a câmara e, em seguida colocar vaselina adicional ao longo da extremidade do CS para assegurar, além disso, será estanque ao ar. Fino-ajustar o ângulo da borda NCC novamente para corrigir qualquer movimento durante o processo de selagem. </li><li> Carregar o reservatório que não irá conter o suspeito chemotactant primeira (Fig. 2B). Fazê-lo através do carregamento de uma seringa de 1 ml (25 G x 1,5 pol agulha), com cerca de 300 ul de meio pré-incubado e injectar o meio para dentro do reservatório até completa (tendo cuidado para não gerar quaisquer bolhas no reservatório). Ligue o reservatório em ambos os lados com um sufficient quantidade de vaselina antes de carregar o próximo reservatório. </li><li> Repita o passo 2.7, só que desta vez com o meio-incubadas contendo o chemotactant candidato. É crítico ao gerar um gradiente molecular através da cultura para sempre carregar o reservatório que contém a molécula a ser testado após o carregamento do reservatório sem a molécula testada. </li><li> Coloque a câmara Zigmond carregada a 37 ° C a incubar durante 1 h antes da filmagem. Imagem a reta borda da cultura NCC durante 3 horas a 90 s intervalos de tempo de incubação a cerca de 37 ° C (Fig. 2A, B). Antes de criar qualquer filme, certifique-se de alinhar a câmera para que a borda das imagens a serem obtidos estão alinhados com e tocar a borda da ponte que faz fronteira com o último reservatório carregado (Fig. 2B, painel superior, caixa tracejada representa ideal posição para geração de imagens). Isto irá facilitar a análise de software mais tarde, padronizando a direção do gradiente molecular aplicada e thdistância a partir do reservatório e filmado em cada filme produzido. </li><li> Para os controlos, repetir as etapas de 2,2-2,9 para cada uma das duas outras culturas NCC seleccionados (no passo 2.1), mas cada encher o reservatório com um meio apropriado. Para um tipo de controlo preencha os dois reservatórios previamente incubado com meio não contendo a molécula a ser testada. Para um tratamento de controle de segunda, primeiro a ponte com algumas gotas de meio-incubadas contendo o chemotactant suspeita antes da montagem do CS. Em seguida, carrega ambos os reservatórios com o mesmo meio contendo o chemotactant suspeita. </li><li> Use ImageJ (NIH) Tracking Manual <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / faixa / track.html)</a> e Quimiotaxia e Migration Tool v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de / aplicativos / ap_chemo.html)</a> plugins para rastrear a migração dos CBCs periféricos ao longo da fronteira reta da cultura just fotografada e analisar vários parâmetros das trajectórias migratórias obtidos (Fig. 2B-C). </li></ol> 3. Resultados representativos: Uma amostra de trajectórias de células a partir de um filme em que NCCs tronco muitos foram responsivo a um quimioatraente candidato utilizando a técnica acima é mostrado (Fig. 2D). A maioria das células no presente exemplo de uma resposta positiva exibido um movimento líquido se o gradiente chemoattractant (como mostrado a vermelho). Dados da trajectória pode ser utilizado para analisar outras propriedades de migração celular, bem. A fim de avaliar visualmente um gradiente aplicado numa câmara Zigmond modificado, um Alexa Fluor 488 conjugado IgM (MW ~ 900 kDa) foi carregado para o segundo reservatório de uma câmara Zigmond modificado (a cerca de 40 ug / ml de H 2 O). Um gradiente foi estabelecida por 1 h e ainda um pouco presente após 26 horas, mas fortemente diminuída em 50 h (Fig. 3). Se a molécula a ser testada é menor, em seguida, aplicada ao gradiente wivai degradar mais rapidamente do que o que é mostrado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" /> Figura 1. Explantes de tronco de nível de NTs para cultura durante a noite em fibronectina revestidos lamínulas. Porque delaminate tronco NCCs do NT dorsal localizado adjacente ao somitos 8-28, este segmento do NT é isolado por microdissecção e cultivadas durante a noite em um CS fibronectina revestido para permitir a emigração de NCCs do explante NT. NTs isoladas que estão entre 8-15 somitos longa e relativamente simples são os mais adequados para o cultivo durante a noite, já que tendem a produzir culturas NCC com mais fronteiras retas. Regiões do tubo neural, que dão origem a outros níveis axiais da crista neural são mostrados em uma fonte menor. s, somito. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" /> Figura 2. Método para a avaliação da migração dos CBCs tronco explantadosutilizando uma versão modificada câmara Zigmond. (A) culturas tronco alongados NCC são preparadas por cultura durante a noite de NTs e culturas resultantes NCC com pelo menos uma fronteira longa e reta são selecionadas para experimentação. A maior fronteira reto de uma cultura seleccionada é então posicionado perpendicularmente à borda da ponte-reservatório, e, portanto, paralela ao vector do gradiente aplicado futuro. (B) Depois do ajuste preciso da posição do NCC cultura na câmara de vedação e Zigmond a lamela para a câmara, a câmara é carregada. Ao testar a quimiotaxia, o reservatório que não irá conter o chemotactant suspeita (-) é carregado em primeiro lugar e selado. Em seguida, o outro reservatório é carregado com o chemotactant suspeita (+) e selada. NCCs periféricos ao longo da fronteira previamente selecionados podem ser analisados ​​e monitorados usando o plugin manual de Rastreamento para ImageJ (painel inferior). (C) Numerosas características migratórias em respostapara o gradiente aplicado pode ser avaliado com base nos dados de controle. Por exemplo, um índice de quimiotaxia pode ser calculado dividindo o deslocamento de uma célula ao longo do eixo x pela distância total que migrou. (D) Um exemplo de uma resposta atraente é mostrada por um gráfico de trajectória de células inicialmente gerado pela quimiotaxia e migração plugin de ferramenta para ImageJ. O ponto de partida de cada percurso está definido para a origem (0,0). Observe quantos mais células migram para o centro de massa source.The quimioatraente de todas as células na sua posição final (cruz azul, todas as células igualmente ponderados) é também mais perto da fonte quimioatraente. NCCs, células da crista neural, faixas vermelhas, as células que migraram para o reservatório carregado com uma suspeita chemoattractant; faixas pretas, as células que migraram para longe; (+), a concentração mais elevada; chemotactant (-), a concentração mais baixa chemotactant. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" /> <stronperfis g&gt; Figura 3. Intensidade através da ponte de uma câmara Zigmond modificada em diferentes tempos após a adição de um conjugado de Alexa Fluor 488. IgM A câmara foi carregado de um modo semelhante ao descrito no protocolo, com as excepções de que a água previamente incubado principais (em vez de meio de pré-incubado) foi utilizado para diluir o anticorpo a 40 mg / ml, e as bolsas de ar pequenas estavam presentes nas extremidades da ponte (longe do segmento onde os perfis de intensidade acima foram tiradas). Inicialmente, nenhum gradiente estava presente na maior parte da ponte. Por um gradiente ha foi estabelecida e continuou presente até 26 h. Por 50 h, a presença do gradiente era inconsistente em diferentes áreas da ponte, e, quando presente, o grau de inclinação do gradiente foi grandemente diminuída. Todos os perfis foram gerados a partir de uma fatia idêntico através da ponte (a partir de uma fronteira ponte reservatório para o outro), utilizando o software AxioVision 4.6. Note que, mesmo enquanto o arbolsos estavam presentes, o gradiente não foi interrompida. , Intensidade elevada de altura; baixa, baixa intensidade; eixo x a distância, através de toda a largura da ponte (2 mm), (+), o reservatório carregado com a Alexa Fluor 488 conjugado IgM, (-), o reservatório não carregado com o conjugado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" /> Figura 4. Modificados especificações da câmara. Zigmond mostrado é um diagrama da câmara de Zigmond modificado usado aqui, juntamente com as suas especificações dimensionais (± 0,2 mm). As medições podem ser moderadamente ajustados de forma a coincidir com as preferências individuais. Suplementar Protocolo: Fabricação de um Zigmond Modificado Câmara Por favor consulte a figura 4, tal como uma referência para o protocolo abaixo: <ol><li> Comprar uma folha de 3/16 &quot;de acrílico grosso polido (4,45 mm de espessura real). </li><li> Usando uma serra de mesa, cortar espaços em branco da câmara de grandes dimensões para adimensões aproximadas de 33,25 milímetros x 64,57 milímetros. Isso permite que 3,175 mm material extra para usinagem. </li><li> Defina a câmara em branco em um torno. Com uma máquina de moagem e um de 6,35 mm (1/4 &quot;) bit fresa de topo, o acabamento dos lados da câmara, para as suas dimensões exactas: 30,07 milímetros x 61,39. </li><li> Posicione a câmara em branco na máquina de fresagem e localizar o centro do branco ao longo de ambos os eixos X e Y com um localizador de extremidade, então zero a posição do centro. </li><li> Adquirir a altura da câmara (eixo z), tocando o bit de fresa de topo com a superfície de topo e de zero a altura. </li><li> Usando um milímetro 3,91 (0,154 &quot;) bit fresa, compensar a 3,03 milímetros de bits ao longo do eixo x (sentido positivo) para o primeiro reservatório. Comece a maquinagem no interior da câmara, até uma profundidade de 2,84 mm, enquanto se move ao longo do eixo y (sentido positivo) a 7,62 mm (0,300 &quot;) e, em seguida, percorrem a 7,62 mm (0,300&quot;) na direcção (negativa), em frente a um reservatório completo comprimento de 15,24 mm (0,600 &quot;). Compensaro bit a 3,03 mm (0,119 &quot;) ao longo do eixo x (sentido negativo) e repetir o processo para o segundo reservatório. </li><li> Posicionar a câmara na sua extremidade e um furo com um milímetro 1,09 (0,043 polegadas) da broca na extremidade de cada reservatório (4 total) que liga a extremidade do reservatório para o lado da câmara de carga média durante a experimentação. </li><li> Mergulhe a câmara bem em água morna e sabão para ajudar a remover quaisquer contaminantes químicos. </li><li> Embeber e enxaguar a câmara poço de água duplamente destilada para remover qualquer sabão. As câmaras estão agora prontos a usar, tal como descrito acima. </li></ol>

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	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Realização de pesquisas sobre a quimiotaxia NCCs tronco provou um desafio para uma série de razões. NCCs tronco constituem uma população heterogénea de células estaminais que se diferenciam de cultura de longo prazo, por isso, NCCs tronco deve ser obtido a partir de explante primário do tronco NT-nível. Os métodos convencionais para estudar a resposta quimiotáctica de forma homogénea as populações de células in vitro são distribuídos difícil de testar em NCCs tronco desde que eles exigem que ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Científico </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Solução penicilina estreptomicina </td><td> Omega Científico </td><td> PS-20 </td><td> Concentração da 100X </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Omega Científico </td><td> GS-60 </td><td> Concentração da 100X </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Omega Científico </td><td> FB-11 </td><td> Lote # 105247 (ou outro que é comparável) </td></tr><tr><td> Modificado Zigmond câmara </td><td> Home made </td><td> N / A </td><td> Volume do reservatório: ~ ea 160 ul, para especificações adicionais, ver fig. 4 e o protocolo de fabricação suplementar </td></tr><tr><td> Placa de cultura de células </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> Banco 10X preparado por diluição de 1 mg em 1 ml de FN H 2 O e 9 ml de DMEM </td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Pescador </td><td> 12-548 B- </td><td> Previamente limpas, 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 médio </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vaselina </td><td> Conforta </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Tubo de centrífuga </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Sistemas celulares </td><td> 4Z0-850 </td><td> Concentração da 10X </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Agulha </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 pol </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Eunvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Estoque é de 2 mg / ml; 7 moles de corante / mole IgM </td></tr><tr><td> Pinças de dissecação </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont n º 5 ou 55; reta ponta, aço inox ou titânio </td></tr><tr><td> Agulha de tungstênio </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Home made; colocada num suporte pino </td></tr><tr><td> Fórceps Blunt </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Utilizado para transferência de embriões para Ringer de gema de ovo </td></tr></tbody></table> Suplementar Protocolo: Fabricação de um Zigmond Modificado Câmara Por favor consulte a figura 4, tal como uma referência para o protocolo abaixo: <ol><li> Comprar uma folha de 3/16 &quot;de acrílico grosso polido (4,45 mm de espessura real). </li><li> Usando uma serra de mesa, cortar espaços em branco da câmara de grandes dimensões com as dimensões aproximadas de 33,25 milímetros x 64,57 milímetros. Isso permite que 3,175 mm material extra para usinagem. </li><li> Defina a câmara em branco em uma vise. Com uma máquina de moagem e um de 6,35 mm (1/4 &quot;) bit fresa de topo, o acabamento dos lados da câmara, para as suas dimensões exactas: 30,07 milímetros x 61,39. </li><li> Posicione a câmara em branco na máquina de fresagem e localizar o centro do branco ao longo de ambos os eixos X e Y com um localizador de extremidade, então zero a posição do centro. </li><li> Adquirir a altura da câmara (eixo z), tocando o bit de fresa de topo com a superfície de topo e de zero a altura. </li><li> Usando um milímetro 3,91 (0,154 &quot;) bit fresa, compensar a 3,03 milímetros de bits ao longo do eixo x (sentido positivo) para o primeiro reservatório. Comece usinagem para dentro da câmara, até uma profundidade de 2,84 mm, enquanto se move ao longo do eixo y ( positivo sentido) a 7,62 mm (0,300 &quot;) e, em seguida, percorrem a 7,62 mm (0,300&quot;) na direcção (negativa), em frente a um comprimento de reservatório completo de 15,24 mm (0,600 &quot;). Compensar o bit a 3,03 mm (0,119 &quot;) ao longo do eixo x (sentido negativo) e repetir o processo para o segundo reservatório. </li><li> Posicione a câmara em sua bordae um furo com um milímetro 1,09 (0,043 polegadas) da broca na extremidade de cada reservatório (4 total) que liga a extremidade do reservatório para o lado da câmara de carga média durante a experimentação. </li><li> Mergulhe a câmara bem em água morna e sabão para ajudar a remover quaisquer contaminantes químicos. </li><li> Embeber e enxaguar a câmara poço de água duplamente destilada para remover qualquer sabão. As câmaras estão agora prontos a usar, tal como descrito acima. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Células da crista neural (CBCs) são uma população transitória de células presentes no desenvolvimento de vertebrados que emigram do tubo neural dorsal (NT) depois de passar por um 1,2 transição epitelial-mesenquimal. Após EMT, NCCs migrar grandes distâncias ao longo de caminhos estereotipados até que eles atinjam seus alvos. NCCs diferenciar em uma vasta gama de tipos de células incluindo neurónios, glia, melanócitos e células cromafins 1-3. A capacidade do NCC para chegar e reconhecer os seus locais de destino adequados é fundamental para a formação adequada de todas as estruturas que contêm NCC-tronco derivadas de componentes 3. Elucidar os mecanismos de orientação para o tronco NCC migração tem sido, portanto, uma questão de grande importância. Numerosas moléculas têm sido demonstrados para orientar a migração NCC 4. Por exemplo, os CBCs tronco são conhecidos por ser repelida por pistas de orientação negativas, tais como Semaforina, Efrina, e ligandos de fenda 5-8. No entanto, nãoaté recentemente tem quimioatractivos de NCCs tronco foram identificados 9. Convencional em abordagens in vitro para estudar o comportamento quimiotática de células aderentes trabalhar melhor com imortalizados, homogénea células distribuídas, mas são mais difíceis de aplicar a certas culturas primárias de células-tronco que, inicialmente, não possuem uma distribuição homogênea e rapidamente diferenciar (como NCC). Uma abordagem para homogeneizar a distribuição dos CBCs tronco para quimiotaxia estudos é isolar NCCs tronco a partir de culturas de explantes primários NT, em seguida, levantar e replate-los a ser quase 100% confluentes. No entanto, esta abordagem de revestimento requer quantidades substanciais de tempo e esforço para explantar células suficientes, é duro, e distribui NCCs tronco de um modo diferente daquele que foi encontrado em condições in vivo. Aqui, apresentamos uma abordagem in vitro que é capaz de avaliar quimiotaxia e outras respostas migratórios de tronco sem NCC requiringa distribuição celular homogênea. Esta técnica utiliza lapso de tempo de imagem de principal, imperturbável NCCs tronco dentro de uma câmara de Zigmond modificado (uma câmara Zigmond padrão é descrito em outra parte 10). Ao expor NCCs tronco na periferia da cultura a um gradiente chemotactant que é perpendicular à sua direccionalidade previu natural, alterações na polaridade migratório induzidas pelo gradiente chemotactant aplicada pode ser detectado. Esta técnica é pouco dispendioso, requer a cultura de apenas dois explantes por tratamento NT replicate, evita levantamento célula dura (tal como tripsinização), deixa NCCs tronco de uma distribuição mais semelhante a condições in vivo, reduz a quantidade de tempo entre o explante e experimentação (o que provavelmente reduz o risco de diferenciação), e permite a avaliação de lapso de tempo de numerosas características migratórias.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.

Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K visualizações.  California State University, Northridge. Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.

Vídeo: Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-análise de estrutura e função cerebral usando ressonância magnética funcional e imagem ponderada em difusão

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...