O ácido hialurônico é uma das matrizes extracelulares mais abundantes em modelo animal. A importância do ácido hialurônico no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada. Este modelo in vitro é útil para explorar como as células da crista neural aderem e migram dentro da matriz extracelular rica em ácido hialurônico.
Com nossa técnica, podemos avaliar a migração e a capacidade de degradação do AH tanto da população atacadista quanto de células individuais ao longo do tempo. Além disso, essa técnica pode ser usada para triagem de drogas para encontrar compostos que acelerem ou impeçam a degradação do AH. Para começar, dilua a matriz da membrana basal com PBS resfriado na proporção de 1:50 e mantenha-a no gelo.
Cubra uma placa de cultura de 10 centímetros com 10 mililitros da solução de matriz diluída e incube a placa à temperatura ambiente por uma hora. Lave o prato três vezes com dois mililitros de PBS. Para cultivar as células O9-1 na placa revestida com matriz, aquecer o tronco embrionário completo ou meio de células ES em banho-maria a 37 graus Celsius.
Misture suavemente a suspensão de células O9-1 e conte o número de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, ajuste a concentração celular para 1,1 milhão de células por mililitro com o meio celular ES completo. Adicione oito mililitros de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura de 10 centímetros revestida com matriz e semeie as células O9-1 a 1,1 milhão de células por placa.
Incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, substitua o meio por meio de célula ES completo fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius. Substitua por meio fresco a cada dois ou três dias a partir de então.
Lave a placa de cultura com dois mililitros de PBS e, em seguida, adicione dois mililitros de 0,25%Tripsina-EDTA pré-aquecido. Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Adicione dois mililitros de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura e transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mililitros.
Centrifugar o tubo a 300g por cinco minutos e descartar o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Adicione dois mililitros de meio celular ES completo pré-aquecido ao tubo e ressuspenda completamente as células por pipetagem. Em seguida, semeie as células em uma nova placa de cultura na densidade celular desejada.
Adicione cuidadosamente 50 microlitros de trietoxissilano não diluído a uma placa de fundo de vidro de 3,5 centímetros e incube por cinco minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Lave a placa três vezes com dois mililitros de água destilada e adicione 50 microlitros de glutaraldeído 0,25% diluído 100 vezes em PBS por prato. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos, depois lavar quatro vezes com dois mililitros de PBS e revestir os pratos com 300 microlitros de colagénio tipo um em 0,2 ácido acético normal à temperatura ambiente durante uma hora.
Novamente, lave três vezes com dois mililitros de PBS. Adicionar 300 microlitros de 200 microgramas por mililitro de fluoresceinamina, marcado hialuronato de sódio H2 a cada prato e incubar durante a noite à temperatura ambiente. Lave novamente com dois mililitros de PBS três vezes.
Depois de secar o prato de fundo de vidro revestido, prenda as duas pastilhas de cultura bem às louças e preencha as pastilhas externamente com um mililitro de PBS. Semeando as células O9-1 nos poços a 10.000 células em 100 microlitros de DMEM contendo 2% de soro fetal bovino ou FBS por inserção. Cultivar as células por dois dias a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5%, capturar imagens de contraste de fase como ponto de partida de tempo, usando um microscópio de fluorescência tudo-em-um.
Remova as pastilhas cuidadosamente das placas de fundo de vidro revestidas com pinças e lave suavemente as placas de fundo de vidro revestidas com dois mililitros de PBS para remover as células e os detritos celulares. Adicione dois mililitros de DMEM fresco contendo 2% FBS nos pratos cultivados. Cultivar as células por mais 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e capturar imagens de contraste de fase após 24 horas e 48 horas em cultura.
Lave a louça com PBS e fixe as células após 48 horas com um mililitro de paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave a louça três vezes por cinco minutos cada com um mililitro de PBS fresco. Finalmente, coloque uma tampa com o meio de montagem para observação morfológica adicional.
Cortes transversais do tubo neural de embriões bandeira Tmem2 em E9.0 são mostrados nesta figura. Os cortes ao nível cranial e tronco do tubo neural foram duplamente marcados para a proteína bandeira Tmem2 e hialuronano. A expressão de Tmem2 foi observada na placa neural e na região da borda do tubo neural, sendo que esses locais estavam desprovidos de coloração hialuronana.
A dupla marcação das células da crista neural para o sinalizador Tmem2 e Sox9 é mostrada aqui. Cortes transversais do tubo neural E9.0 foram corados para Tmem2 flag e Sox9. As imagens representativas de células Tmem2 esgotadas e controle de O9-1 cultivadas em uma placa de cultura regular são mostradas nesta figura.
A expressão de Tmem2 nessas células foi avaliada por qPCR com GAPDH como controle interno para normalização. Células Tmem2 depletadas e controle de O9-1 foram cultivadas por 48 horas em lamínulas de vidro revestidas com hialuronano fluoresceinado. A atividade degradante do hialuronano é revelada como áreas escuras no fundo fluorescente.
O nível de degradação do hialuronano também foi comparado quantitativamente entre células Tmem2 depletadas e células O9-1 controle. A degradação do hialuronano ligado ao substrato nas aderências focais em células O9-1 é mostrada nesta figura. Células O9-1 cultivadas em substratos mistos constituídos por Col1/HA foram imunomarcadas com um anticorpo anti-vinculina.
As manchas ou estrias escuras representam atividade de degradação do hialuronano no substrato FAHA H2. Os sítios de degradação do hialuronano e as aderências focais foram co-localizados nos substratos mistos. O revestimento coval das placas de fundo de vidro com AH é uma etapa crítica do protocolo, pois o revestimento inadequado pode resultar na remoção do AH facilmente pela força mecânica durante a adesão e migração.
Para garantir o revestimento adequado, utilizamos glutaraldeído, colágeno tipo um quimicamente imobilizado ao vidro através de acoplamento armado ao aldeído. É possível usar substrato de matriz extracelular ao lado do colágeno tipo um, mas eles devem ter grupos armadores e pode haver limitações no revestimento coval em placas de fundo de vidro devido às suas propriedades químicas. Portanto, tentativa e erro podem ser necessários para determinar a melhor abordagem.
Este experimento de laboratório pode ser útil no estudo de como certas moléculas funcionam durante o movimento das células da crista neural para o ambiente HA ou HA ao redor do tubo neural. Também pode ser uma maneira útil de testar drogas que podem acelerar ou impedir esse processo de migração. É interessante saber por que o Tmem2 tem as funções de adesão sobre o AH e a degradação do AH e por que o AH precisa ser degradado no local de coesão total.
Como o AH é a substância mais comum na matriz extracelular, descobrir a resposta para essa pergunta é realmente importante na biologia e na medicina. Este protocolo experimental é valioso porque pode ser aplicado a vários tipos celulares, incluindo fibroblastos da pele, células epiteliais e células cancerosas.
