Este trabalho foi financiado pelo DoD Grant PT074620 (SLJ) e Grant NIH R01NS245014 (SLJ).

1. Preparação de reagentes <ol><li> Descongele congelados no gelo Matrigel molhada, deixando tempo suficiente antes do experimento (não acelerar o processo de aquecimento ativo). Matrigel é usado para estabelecer um ambiente 3D muito parecidas com uma matriz extracelular propício para a migração de células. Ele fornece células com ambos um substrato e mecânicos que encerra. Matrigel é armazenado congelado a -20 ° C. Antes de usar, ele deve ser gradualmente trazidos para a temperatura de 0-4 ° C, ou seja descongelado em gelo triturado ou em uma geladeira. Matrigel irreversivelmente conjuntos para formar um gel na temperatura de incubação (37 ° C). Portanto, não é recomendado para acelerar o descongelamento por imersão do recipiente em água morna. </li><li> Frações protéicas são preparados por focalização isoelétrica (IEF) do extrato de proteína total do córtex cerebral pós-natal de dia 0 (P0) furão. Após a separação, as frações são dialisada durante a noite contra a 20mM Tris-HCl pH7.2 para limpar os extratos dos constituintes tampão foco, o que pode ser tóxico ao tecido. </li><li> Sistema de proteína de entrega. Proteínas extraídas do córtex cerebral são adsorvidas em esferas de látex fluorescentes que então liberam lentamente as proteínas para o environment.We descobriu que o recurso de fluorescência ajuda no tratamento visual de microesferas e permite fácil detecção do mesmo spillovers mínima do local de talão de depósito, quando observados em microscópio fluorescente. <ol class="lalpha"><li> Adicionar 10μl de contas fluorescentes para 100-200μl da solução de proteína </li><li> Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente em um agitador </li><li> Girar a contas para baixo em uma centrífuga de bancada para a velocidade máxima de 1h </li><li> Remover o sobrenadante </li><li> Re-suspender em um vórtice utilizando 10μl de meio fresco </li><li> Adicionar 30μl de Matrigel à suspensão, misture bem, e colocar no gelo. </li></ol></li><li> Tampões e meios de comunicação <ol><li> Preparar e esterilizar-filtração do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF; NaCl 124mm, 26mm NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,2 mm, 3,2 mm KCl, MgSO 4 1,2 mm, 2,4 mm CaCl 2, Glicose 10mM). Slush-congelar a ACSF de antemão, que ele está pronto no momento da dissecção dos tecidos. Para fazê-lo, coloque um frasco de plástico cheio de ACSF estéril em um freezer -80 C °. Monitor de congelamento de vez em quando, então, quando uma camada de gelo se acumula no interior da parede, quebrá-lo e misture com o líquido. Repita até que o frasco contém principalmente uma lama gelada. Buffer preparado desta forma não só apoia a sobrevivência do tecido, mas também irá realizar mais baixa temperatura, e é mecanicamente menos prejudicial para o tecido do que cubos de gelo chunky. </li><li> Prepare médio Neurobasal com N-2 e B-27 suplementos adicionados de acordo com sugestões do fabricante, bem como gentamicina 1mg/100ml, 2 mM L-glutamina e glicose 0,6%. Esterilizar por filtração através de uma membrana 0.22μm. Manter aquecida a 37 ° C até o uso. </li></ol></li><li> Placas de cultura <ol class="lalpha"><li> Cultura grade de plástico de seis pratos bem são preparados por dotting cada poço em seu centro com uma pequena quantidade (cerca de 2μl) de Matrigel frio utilizando 20μl ponta da pipeta, e colocando uma lamela de vidro autoclavados rodada 18 milímetros em cada gota. Nem as placas nem as lamelas necessidade de ser de outra forma de cultura, tratadas. </li></ol></li></ol> 2. Preparação dos tecidos <ol><li> A obtenção do tecido cerebral <ol class="lalpha"><li> Depois profundamente anestesiar o animal com Euthasol, remova o cérebro e colocá-lo na gelada ACSF </li><li> Separar os hemisférios com um bisturi e corte coronal em 500μm usando um dispositivo de escolha, coleta de fatias em um pequeno prato contendo gelada ACSF </li></ol></li><li> Explantes fazer (use microscópio de dissecação) <ol class="a"><li> Identificar fatias contendo as eminências ganglionares (GE) e regiões da guarnição do córtex que podem curvar sobre o GE e interferir com novas medidas </li><li> Pressione uma Harris Uni-Core furo na região próxima à superfície ventricular da GE, retraia um núcleo contendo predominantemente uma zona ventricular, e expulsá-lo com um êmbolo no meio gelada (Fig.1). Três a quatro explantes de 0,5 mm de diâmetro podem ser feitas a partir da GE na única fatia do cérebro P0 furão. Por favor, note que em ambos os roedores e ferrets, os GEs medial e lateral são fundidos nesta idade. Se um núcleo fica na fatia ou está preso ao fundo do prato de plástico, mobilizá-lo por esguichando ACSF com uma ponteira de pipeta e transferir com uma pipeta no prato contendo meio Neurobasal frio. Mantenha o prato sobre gelo molhado. </li><li> Transferência de um lote de explantes do meio em uma queda grande de gelado Matrigel (cerca de 0,25 0,5 ml) colocados em um prato separado, tendo o cuidado de ter os explantes totalmente imersa e evitando bolhas. Mantenha o prato sobre gelo molhado. O tamanho de um lote depende da velocidade do fluxo de trabalho a jusante. </li></ol></li></ol> 3. Configuração da cultura (uso de microscópio de dissecação) <ol><li> Manter sempre Matrigel e Matrigel contendo mistura no gelo para evitar a cura. </li><li> Remix da suspensão de esferas e coloque 1-2μl ou menos da suspensão de esferas na gelada Matrigel no centro de uma lamela de vidro previamente colocados em uma placa de cultura bem usando uma ponteira 20μl. Deixe-a definir um pouco, evitar a dessecação. </li><li> Usando uma ponteira 20μl pegar dois explantes da queda Matrigel e colocá-los nas imediações do depósito desejado talão (pelo menos um milímetro de distância da borda do depósito) simetricamente em lados opostos. Deixa por não mais de 5min à temperatura ambiente. O tempo certo de passos b e c é crítica. Se o tempo é curto demais ele irá levar a gelificação incompleta e componentes da instalação da cultura vai passar quando eles estão cobertos com a camada final de Matrigel; se o tempo é muito longo pode resultar em excesso de secagem do gel e criação de barreiras físicas que impedem a livre circulação das células. </li><li> Cobrir as contas e o explante com uma camada plana de cerca de 30μl de Matrigel, estendendo-o para além dos explantes (Fig.2). Deixe-a definir na incubadora por aproximadamente 15 minutos. </li><li> Adicionar 2ml de meio de Neurobasal com suplementos. </li><li> Incubar a 37 ° C em 5% de CO O 2 / 95% a atividade de monitoramento 2 migratórias diária. </li></ol> 4. Ao vivo de imagens <ol><li> Após a incubação por 3-4 dias, rever a placas de cultura e escolha lamínulas de interesse. Os explantes devem gerar uma nuvem radialmente uniforme de células. Substituir lamínulas escolhido em uma placa de cultura fresco que será usado na geração de imagens ao vivo. </li><li> Deixe as lamelas sentar-se no novo prato durante a noite. Antes de colocar a placa no microscópio para imagens, em uma capa de cultura de células, use uma espátula estéril para mover a lamínula, a fim de liberar qualquer microbolhas que recolhem entre a lamínula ea placa de cultura de células. Interferência de bolhas vai arruinar as imagens. Mover as lamelas para o centro do poço. </li><li> Para evitar a evaporação, preencher o espaço entre os poços com água. </li><li> Transferir cuidadosamente a placa da capa de cultura de células ao microscópio para não mover as lamelas do centro do poço. </li><li> Definir um esquema de imagens utilizando o software de imagem. Devido à natureza da configuração 3D cultura as células também se move na vertical, por isso, é importante recolher Z-aviões abrangendo profundidade total da nuvem de migração. A extensão XY de uma área analisada também deve ser suficientemente grande para cobrir áreas previsto para ser povoada com as células migram durante o curso de gravação, e para conter o depósito talão, a fim de gravar uma orientação angular do explante e células migram em relação ao a fonte de proteína. Considere também que os aviões mais fotografada Z, ou o mais área coberta, mais tempo leva para gravar um ciclo em um ponto determinado momento, forçando intervalos maiores de tempo entre amostras e uma perda de resolução temporal de rastreamento de celular. No nosso caso, utilizando objetiva de 10x, o esquema ideal era uma gravação de azulejos de 3x3 para cada um dos 10 Z-aviões espaçadas a cada 20Hm, em intervalos de 30min. Encontrámos 30 min intervalos mais longos do que permite a identificação inequívoca das células em momentos consecutivos, o que é crítico para o rastreamento confiável de seus movimentos. </li><li> Iniciado imagem lapso de tempo. </li><li> Após o tempo desejado, retire a placa e corrigir as culturas em 4% tamponado paraformaldeído. Ele pode ser usado para análise posterior morfológicos e imunocitoquímicos. </li></ol> 5. Análise do movimento <ol><li> Converter a série de tempo de gravação de imagens em um formato mais conveniente para processamento posterior, TIFF sendo a mais portátil. </li><li> Rastrear o movimento de células individuais ao longo do tempo por coordenadas XY de gravação. Isto pode ser feito usando o software disponível gratuitamente como ImageJ (NIH), com um Tracking Manual plug-in, ou qualquer outra aplicação comercial, como ImagePro, Volicity ou Autoquant. </li><li> Plot as faixas usando o Excel ou in-house software desenvolvido. </li><li> Para cada célula rastreado calcular parâmetros cinéticos como velocidade média, a curvatura do caminho, a variabilidade direcional ao longo do tempo, a ramificação, o desvio em direção à fonte de proteínas, cálculos, etc pode ser feito em MS Excel ou qualquer planilha equivalente. Nossa experiência indica, porém, que é muito mais produtivo para o desenvolvimento in-house scripts (usando R, Matlab, Python, Perl ou outras linguagens em sua imensa parte), pois eles permitem uma maior personalização flexível e inclusão de mais sofisticado do que os métodos analíticos disponíveis em uma instalação básica do Excel. </li></ol> 6. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama do origi anatômicasn de explantes. Este é um desenho de um corte coronal do cérebro ferret hemisected. Os círculos cinza indicam a região a partir do qual os explantes foram tomadas. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Diagrama de uma configuração de cultura. O depósito de talão é a fonte de proteínas; os explantes são colocados de ambos os lados e todos os elementos são cobertos com Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Parcelas correspondentes de faixas de células coloridas por quadrantes (flechas apontam para o depósito talão). As faixas de células à direita estão migrando em direção a fração D, que parece atrair as células, as células do lado esquerdo estão migrando para fração A, que aparece para repelir as células migratórias. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A) Uma série de imagens de timepoints selecionados mostrando uma nuvem de crescimento de células a migrar para fora de um explante. Uma célula exemplo, indicado por uma seta, é monitorado através do tempo, conforme indicado abaixo (barra de escala 200μm). Este explante foi visualizado com imagens ao vivo por 38 h. Mostrados aqui são imagens de células deixando o explante a partir do início da gravação das imagens para a imagem final. B) A célula indicada na parte A nos horários indicados. A célula mostra a ramificação repetitivos (barra de escala de 50 ìm).

<ol>
	<li>Caviness, V. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cortical+development:+a+view+from+mutations+in+mice.">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li><li>Gelman, D. M., Martini, F. J., N&#243;brega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons.">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li><li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia.">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li><li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., G&#246;tz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis.">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riding+the+glial+monorail:+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain.">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+neuronal+migration.">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li><li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes.">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li><li>M&#233;tin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Moln&#225;r, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development.">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li><li>Martini, F. J., Valiente, M., L&#243;pez Bendito, G., Szab&#243;, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li><li>N&#243;brega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors.">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li><li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+for+neuronal+migration.">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li><li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia.">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+neural+cell+migration.">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li><li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres.">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li><li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex.">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li></ol>

Uso de animais: Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a USUHS e diretrizes institucionais NIH e aprovado pelo IACUC USUHS.

Aqui apresentamos um sistema simples para estudar e analisar o comportamento migratório de células neuronais em resposta a estímulos químicos. Em ensaios de migração in vitro têm sido usados ​​para identificar as moléculas extracelulares que afetam a locomoção de células. Nosso paradigma garante que cada célula estudada tem um ambiente 3-dimensional (3D) com os quais interagem. É uma vantagem considerável sobre as culturas onde as células migram para fora de explantes são forçados a mover-se sobre a superfície plana de poli-D-lisina revestido lamela, portanto, desprovida de interações com a matriz extracelular (por exemplo, Hirschberg et al &#39;10;. 8. Metin et al. &#39;07). No entanto, com relação à maior escala de rastreamento de células migratórias, continua a ser de 2 dimensões, como as células são verticalmente restrito ao espaço entre as lamelas de vidro na parte inferior e a superfície superior do Matrigel, que é relativamente fina em comparação com a liberdade horizontal da migração. Tal configuração permite a fácil análise do movimento, que ainda permanece essencialmente 2-dimensional. Similar paradigmas 3D consistindo de explantes GE ou re-agregados de células GE embutidos em colágeno ou Matrigel, anteriormente empregado, utilizando agregados de células que expressam uma determinada proteína de sinalização como uma fonte de pistas químicas (por exemplo &#39;07 Liodis et al;. Martini et .. al &#39;09;. Nóbrega-Pereira et al 08; Wichterle et al &#39;03).. O método aqui apresentado utiliza um sistema de liberação lenta na forma de esferas de látex com proteínas aderido para permitir um nível sustentado no ambiente local, que é maior do que proteínas adicionado diretamente ao meio, tornando o sistema particularmente adequado quando a quantidade de disponíveis proteína é limitado ou quando uma mistura complexa de proteínas é testada. A escolha de contas não se limita ao látex à base de produtos, e inclui também outros materiais, por exemplo, contas de agarose, cada um com características diferentes. Para aumentar ainda mais a densidade do ensaio, foram utilizados dois explantes apposed ao depósito contas em lados opostos. Para garantir uma área específica de origem, temos usado explantes eminência ganglionar como fonte de células. Foram avaliadas diferenças em porções medial e lateral da eminência ganglionar, mas não vejo qualquer diferença. Devemos salientar que este estudo utiliza furões; nesta espécie as eminências medial e lateral ganglionares fusível mais cedo do que em roedores (Poluch et al 08.). No momento em que as culturas foram feitas (P0) as eminências ganglionares medial e lateral foram fundidos, embora muitas células preencher o neocórtex ainda estão sendo gerados e migração. No entanto, se uma fonte verdadeiramente homogênea de células é preferível, uma suspensão de células pode ser preparado a partir do tecido dissecado e diretamente misturado com o Matrigel, ou, alternativamente, girou para baixo e uma pelota resultando perfurado para fazer &quot;explantes&quot;. Uso de digestão enzimática do tecido para preparar a suspensão celular é desencorajado, pois mesmo resíduos de atividade proteolítica pode liquefazer Matrigel ao longo do experimento. Além disso, uma diligência tem de ser aplicado para o momento da instalação da cultura. Embora Matrigel requer um período de aquecimento para polimerizar, mesmo período um pouco prolongado de exposição de pequenas gotas de Matrigel (como utilizado neste protocolo) para o ar faz com que a secagem e resulta em um shell que é impenetrável para as células migram e que não podem ser apagados cobrindo posterior com Matrigel fresco.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </td><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Médio Neurobasal (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 suplemento (100X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Suplemento (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel Matrix Membrana Basal </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Uni-Core, tamanho 0,5 milímetros </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 69036-05 </td><td> Soco furo </td></tr><tr><td> Verde Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc. </td><td></td><td> Microesferas de látex </td></tr></tbody></table>

migratory behavior of cells generated in ganglionic eminence cultures

Migração de células é um processo comum que leva ao desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central de vertebrados (Hatten, 99). O córtex cerebral é composto por dois tipos básicos de neurônios: excitatórios e inibitórios. Essas células surgem em áreas distintas e migrar para o córtex ao longo das rotas diferentes (Pearlman et al., 98). Interneurônios inibitórios migrar tangencialmente a partir de fontes subcortical, principalmente a partir de diferentes regiões do eminências ganglionares (Gelman et al, &#39;09;. Xu et al, &#39;04).. Seu movimento espaço-temporal requer um controle preciso impostas por estímulos ambientais, para permitir o estabelecimento de adequada citoarquitetura e conectividade no córtex cerebral (Caviness &amp; Rakic, 78; Hatten, &#39;90; Rakic, &#39;90). Para estudar o comportamento migratório de células geradas em zonas proliferativa das eminências ganglionares (GE) em furões recém-nascido in vitro foi utilizado um arranjo de três dimensões em uma cultura Matrigel BD Matrix. A configuração de cultura consistiu em dois explantes GE e uma fonte de proteínas testadas extraído do córtex cerebral e adsorvido em fluorescentes Retrobeads latex IX posicionado entre os explantes (Hasling et al, &#39;03;. Riddle et al, 97.). Depois de 2-3 dias de cultura, as células começam a aparecer na borda do explante mostrando uma propensão a deixar o tecido em uma direção radial. Imagens ao vivo permitiu a observação de padrões migratórios sem a necessidade de rotulagem ou marcação das células. Quando expostas a frações da proteína extrato obtido de córtex ferret isocrônico, as células GE apresentado comportamentos diferentes, a julgar pela análise cinética quantitativa de células individuais em movimento.

Watch this Scientific Journal Video about Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures at JoVE.com

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Imagem lapso de tempo de cultura de tecidos 3D permite estudar o comportamento migratório de células individuais provenientes de eminência ganglionar em reação ao extrato de proteínas fracionadas do córtex cerebral.

Comportamento migratório de células geradas em culturas Eminence ganglionares

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K visualizações.  Uniformed Services University. Imagem lapso de tempo de cultura de tecidos 3D permite estudar o comportamento migratório de células individuais provenientes de eminência ganglionar em reação ao extrato de proteínas fracionadas do córtex cerebral.

Vídeo: Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Ensaios para detectar estruturas de reflexão de UV e determinar a sua importância na preferência do companheiro usando o Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Combinando Comportamento e EEG para Estudar os Efeitos da Meditação Mindfulness na Memória Episódica

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...