Este trabalho foi financiado por fundos da Medicina e Pesquisa em Saúde doação da Cidade de Paris, os franceses Nacional conceder ANR-09-JCJC-0118-1, ea ERC Começando Grant Projeto RNAvirusPopDivNVax não. 242.719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Escolha da linha celular. A eficácia de análogos de base como RNA mutagénicos correlaciona-se com a sua aceitação em relação a diferentes tipos de células 11. Se a linha de células que é normalmente utilizado para a passagem do vírus se mostra refratária à absorção mutagênico ou muito sensíveis (alta toxicidade celular), pode ser necessário usar uma outra linha de células que atenda a esses requisitos e ainda é permissivo para a replicação viral. Uma vez que a variante resistência mutagênico é isolado, o restante da caracterização pode ser realizada no original linha celular, de preferência. Em nossa experiência, as células HeLa absorver a mutagênico; células BHK requerer até 10 vezes maiores concentrações e células Vero são refratários à captação mutagênico. Escolha de mutagênico. Na tentativa de isolar variantes fidelidade por mutagênico tratamento, a probabilidade de sucesso é maior se houver mais de um tipo de mutagênico é usado. Mutagénicos de base analógica de estrutura diferente, que são erroneamente incorporados genomas durante a replicação será predominantemente induzir resultar em um subconjunto específico de mutações nos ciclos de replicação subsequentes: ribavirina favorece GtoA e mutações de transição CtoU 12; 5 azacitidina tem um viés similar, com a Além de CtoG e transversões GtoC 13; 5-fluorouracil, preferencialmente induz transições Atogue e UtoC 14. Alternativamente, maiores concentrações de Mg 2 + ou Mn 2 + pode ser suplementada ao meio para aumentar a freqüência de mutação dos vírus RNA total, sem o viés descrito acima de 12. Dependendo seqüências do vírus códon, e as mudanças códon necessária para gerar uma variante fidelidade, algumas destas condições irá favorecer o surgimento desta variante em detrimento de outros. Para a maior fidelidade G64S poliovírus e vírus Coxsackie A372V, tratamento ribavirina mais prontamente selecionados para as variantes porque a transição Atogue necessários no local códon correspondeu à mutações predominantemente gerado por este ribavirina. MOI tamanho da população vs. Em virologia, protocolos para a infecção por cultura de tecidos prestar especial atenção à multiplicidade de infecção (MOI), para evitar o acúmulo de partículas defeituoso interferente (baixa MOI) ou para promover a recombinação entre os vírus (alta MOI), para exemplo. Selecionar para eventos emergência sobre serial passaging, também é importante considerar o tamanho da população de vírus. Desde o mutante resistente inicialmente existe em baixa freqüência, é melhor transferir tão grande tamanho de uma população possível de uma passagem para a próxima (10 5 -10 6 vírus, por exemplo) para evitar a perda destas variantes emergentes em cada passagem. Ampliação do tamanho do bem ou frasco (número de células infectadas) podem ajudar a minimizar o aumento do MOI se isso é preocupante. Por outro lado, para experimentos em que a sensibilidade de um vírus para mutagênico está sendo testado, infecção MOI baixa é realizada, a fim de aumentar o número de ciclos de replicação que ocorre no experimento e para evitar resgate de genomas mutagenizados por genomas maior aptidão através de complementação em co-células infectadas. Isso é importante porque as mutações no genoma da progênie gerada durante a primeira rodada de replicação não será imediatamente detectada. A maioria destes RNAs mutagenizados ainda serão embalados em virion. É na próxima rodada de infecção que as mutações letais presentes nestes genomas resultará em um ciclo de replicação abortada, e redução do título de vírus. Pode ser necessário para permitir várias rodadas de acumulação de mutações antes de um efeito significativo da mutagênese letal é observado. Finalmente, se ao longo da série passagem na presença de agentes mutagénicos, os títulos de vírus continue a cair até a extinção, em seguida, o pesquisador deve tentar passaging vírus gradualmente crescentes quantidades de mutagênico (a partir de uma concentração muito baixa). Mutagénicos isolamento e geração do clone mutagênico RNA resistentes da população RNA mutagênico-resistente. RNA introduzir múltiplas mutações aleatórias para cada genoma, mas a seleção para resistência só irá enriquecer (e corrigir a seqüência de consenso) a mutação de resistência. Para identificar esta mutação, a sequência de população resistente mutagênico (consenso da população) e não vírus individual. Assim, o único, mutações aleatórias criadas pelo mutagênico não são detectados na seqüência, apenas as mutações que resultam em mudanças consenso após a seleção, são encontrados. Em nossa experiência, identificam apenas uma ou duas alterações na seqüência de tal consenso. Uma vez que a população resistente mutagênico é obtida e a mutação de resistência é identificada, é necessário para gerar um estoque de mais puro desta variante. Acima, descrevemos um procedimento de purificação de placa. Alternativamente, se o vírus de interesse não produz placas facilmente identificáveis, a variante desejada pode ser Purified limitando diluição. Esta abordagem é, essencialmente, a 50 TCID em formato de 96 poços, onde o estoque de vírus é diluído de tal forma que menos de 50% dos poços estão infectados. Usando esta diluição, a mesma abordagem que acima foi tirado, de isolar até 10 variantes individuais e confirmando suas seqüências. Como mencionado, no melhor dos casos, um clone infeccioso de cDNA da cepa do vírus está disponível. Isolamento da variante seria, portanto, não ser necessário. Em nossa experiência, fidelidade variantes são o resultado de um único substituições de aminoácidos e pode assim ser gerados usando simples, kits mutagênese comercializado como Quikchange (Agilent). A opção secundária é a utilização de um clone de cDNA de uma cepa intimamente relacionados. No entanto, se uma cepa relacionada é usado, nós sugerimos usando tanto a abordagem deste e isolamento do vírus (purificação de placa, por exemplo) porque descobriram que a mutação mesma fidelidade alterando em dois vírus estreitamente relacionados não vai necessariamente ter o mesmo efeito. Fidelidade e Seleção de replicação. Variantes de RNA mutagênico resistentes resultaram no isolamento de ambas as variantes de maior e menor fidelidade com características de crescimento que são semelhantes aos seus homólogos do tipo selvagem 4,12,15. Atualmente, a ligação entre as taxas de atividade da polimerase e fidelidade não é totalmente compreendido. In vitro estudos bioquímicos utilizando purificada RNA polimerase têm demonstrado que as variantes com maior fidelidade têm taxas de processamento mais lento, enquanto variantes menor fidelidade tendem a ter um processamento mais rápido 1-3,12. Em cultura de tecidos, essas diferenças geralmente não são evidentes, sugerindo que a disponibilidade de recursos, ao invés de cinética de atividade intrínseca da polimerase, é o passo limitante. Se a variante fidelidade repetições, com cinética de que não são significativamente diferentes de tipo selvagem, em seguida, uma comparação de suas freqüências de mutação pode ser feita diretamente. Se uma mudança muito significativa na cinética de replicação existe, então os dados devem ser normalizados para explicar as diferenças cinética, por exemplo, comparando vírus que sofreram o mesmo número de ciclos de replicação. Em nossa experiência, embora nenhuma diferença significativa em uma etapa cinética de crescimento foram observadas entre o tipo selvagem e variantes de alta fidelidade, observou-se que as variantes com maior fidelidade consistentemente mais elevada titulação (dentro de um log) em relação ao tipo selvagem, mas eles fazem um pouco menos RNA (dentro da mesma ordem de magnitude), sugerindo ainda que os genomas que contêm produzir mutações menos e são, portanto, mais infeccioso. Preparação de amostras e seqüenciamento. Para todos os passos nestes protocolos, é imperativo que a alta-fidelidade, uma prova de leitura de enzimas são utilizadas para PCR e RT-PCR para limitar a introdução de mutações adicionais, uma vez que não pode ser distinguido de mutações biologicamente relevantes. É fundamental que as populações de vírus a serem comparados foram preparadas nas mesmas condições (história passagem, meio de cultura de tecidos, a temperatura, método de extração de RNA, RT-PCR protocolos, etc) Também é importante assegurar que o material de partida foi o suficiente obtidos a partir da extração de RNA de modo que uma banda forte é gerada por RT-PCR. A diluição de 1 / 100 da amostra de RNA também deve dar uma banda de RT-PCR detectável, indicando que a amostra contém um número suficiente de moléculas de RNA para evitar viés de representação (amplificação do genoma do mesmo repetidamente). Desde frequência de mutação é uma distribuição, seria de esperar que os valores semelhantes poderão ser obtidas independentemente do tamanho da população, desde o viés referido não está ocorrendo. Como a Figura 6 mostra, a 10 de diluição de 5 vezes de um estoque de vírus dá uma frequência de mutação que não é significativamente diferente do estoque parental. Até que as condições ideais para TopoTA clonagem são encontradas, confirmar a presença de inserções após triagem azul / branco, por colônia PCR antes de seqüenciamento. Como um controle para o ruído de mutação (mutações introduzidas por RT-PCR e sequenciamento), clone de um produto PCR de um rolamento plasmídeo a sequência viral mesmo e / ou clone e seqüência RT-PCR em produtos de RNA transcrito vitro correspondente ao genoma do vírus (seja ciente de que diferentes enzimas de transcrição in vitro têm taxas de erro diferentes e não podem dar informações úteis como para o erro de fundo de verdade em seu procedimento). Algumas seqüências de vírus podem ser tóxica para bactérias, por isso, é importante verificar isso antes de decidir sobre a região do genoma viral a ser sequenciado para a freqüência de mutação. Na análise de seqüências obtidas pelos TopoTA, note que cada clone deve conter apenas inserir um / seqüência. Se um pico duplo é observada, sugerindo uma população mista, é possível que dois vizinhos colônias bacterianas foram selecionados. Também é possível, embora improvável, dada a baixa freqüência de mutação na replicação bacteriana, que a mutação foi introduzida durante a amplificação do plasmídeo na cultura bacteriana. Na placa purified populações, um pico duplo pode representar placas sobrepostas, ou um vírus que está adquirindo uma nova mutação ou reverter uma mutação durante o desenvolvimento da placa. Ser consistente e decidir sobre a contar ou não contar estas mutações. Finalmente, tenha em mente que as freqüências de mutação usadas aqui são valores relativos. Eles são válidos apenas para comparar populações de vírus cultivadas sob a mesma condição, e seqüenciado sobre a mesma região! Eles não devem ser tomados como valores absolutos da taxa de mutação, ou a freqüência de mutação do genoma como um todo. No entanto, quando as condições são controladas, permitem realmente reprodutível, comparações quantitativas de diferenças na distribuição de mutação e de freqüência.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100mg </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA clonagem kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange mutagênese kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Se um clone de cDNA infeccioso está disponível </td></tr><tr><td> De 96 poços miniprep kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporação </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Ou software de alinhamento outras </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Vírus RNA polimerase RNA dependente utilizar RNA para replicar os seus genomas. A taxa de erro intrinsecamente alta destas enzimas é um grande contribuinte para a geração de diversidade populacional extrema que facilita a adaptação e evolução do vírus. Crescente evidência mostra que as taxas de erro intrínseco, e as freqüências de mutação resultante, de vírus de RNA pode ser modulada por sutis mudanças de aminoácidos para a polimerase viral. Embora ensaios bioquímicos existem por algum polimerases RNA viral que permitem a medida quantitativa da incorporação fidelidade, aqui nós descrevemos um método simples de medir freqüências de mutação de vírus de RNA, que provou ser tão precisos como abordagens bioquímicas na identificação de mutações alterando a fidelidade. A abordagem utiliza técnicas convencionais de virológica e seqüenciamento que podem ser executadas na maioria dos laboratórios de biologia. Com base em nossa experiência com uma série de vírus diferentes, identificamos os principais passos que devem ser otimizado para aumentar a probabilidade de isolar variantes fidelidade e gerar dados de significância estatística. O isolamento e caracterização de mutações alterando a fidelidade pode fornecer novos insights sobre a estrutura e função da polimerase 1-3. Além disso, essas variantes fidelidade podem ser ferramentas úteis na caracterização de mecanismos de adaptação do vírus ea evolução 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

O presente artigo descreve os passos necessários para isolar e caracterizar variantes RNA polimerase fidelidade de vírus RNA e como usar dados de freqüência de mutação para confirmar as alterações fidelidade em cultura de tecidos.

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.5K visualizações.  Institut Pasteur. O presente artigo descreve os passos necessários para isolar e caracterizar variantes RNA polimerase fidelidade de vírus RNA e como usar dados de freqüência de mutação para confirmar as alterações fidelidade em cultura de tecidos.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...